采用dCas9-SunTag-DNMT3A技术调控玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平

摘要

旨在探究dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统对玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平及胚胎发育能力的影响,为冷冻卵母细胞/胚胎特定位点DNA甲基化的精确调控奠定基础。本研究将经过体外成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻,随后进行体外受精,将受精所得到的原核胚进行dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统的注射,统计并计算卵母细胞的发育情况;通过亚硫酸盐测序的方式检测IGF2R基因启动子的甲基化水平,并利用荧光定量PCR检测IGF2R及相关基因的表达水平。与冷冻组相比,注射不同浓度的dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统后,只有40 ng·μL^(-1)组显著地提高了玻璃化冷冻卵母细胞IVF后的发育能力(P0.05),但40 ng·μL^(-1)组发育效果仍然显著低于新鲜对照组(P<0.05);对检测冷冻组、新鲜组、40 ng·μL^(-1)组IGF2R基因启动子甲基化水平分析发现,40 ng·μL^(-1)组水平与新鲜组相似,显著高于冷冻组(P<0.05);荧光定量试验结果显示,40 ng·μL^(-1)组IGF2R基因mRNA表达水平相较于冷冻组显著降低(P<0.05),与新鲜组相似。注射40 ng·μL^(-1)的dCas9-SunTag-DNMT3A甲基化编辑系统能够通过有效升高IGF2R基因启动子甲基化水平(P<0.05)及显著降低其mRNA表达水平(P<0.05),来正向调节玻璃化冷冻卵母细胞IVF胚胎的发育情况,提高胚胎发育能力,使得其卵裂率和囊胚率都得到显著提高(P<0.05),同时促进胚胎发育相关基因的表达。