猪CTSD全长cDNA的克隆和表达分析

摘要

以人CTSD mRNA全长序列为基序,在db EST库中搜索同源性大于80%、重叠大于40个碱基的猪EST下载经Seqman软件装配后,利用RT-PCR扩增到猪CTSD基因部分cDNA序列,进一步通过RACE技术获得cDNA全长(GenBank登录号为DQ018727),猪CTSD基因cDNA全长2 032 bp包括93 bp 5'UTR区、706 bp 3'UTR区和1 233bp ORF,编码410个氨基酸残基.其编码区与人、鼠、牛、羊CTSD编码区同源性分别为87.9%、78.2%、86.6%和85.0%,其氨基酸序列与人、鼠、牛、羊氨基酸序列同源性分别为86.6%、80.1%、86.0%和84.7%.疏水性分析和信号肽预测发现猪CTSD氨基酸序列存在至少7个疏水性区域,信号肽位点为第1～20 个氨基酸残基.在NCBI进行Blast P搜索结果显示猪CTSD氨基酸结构中含有Asn(Asparagine,天门冬酰胺)结构域,与天冬氨酸蛋白酶3D结构同源性高达99.7%,具有真核生物天冬氨酸蛋白酶的典型结构.以猪多组织RNA池为模板,以1 026 bp部分cDNA序列作为杂交探针进行Northern杂交,得到一条2 000 bp左右特异条带,从而验证了RACE产物为全长cDNA并揭示该基因只有一个转录本.为了研究猪CTSD基因在体内不同组织内表达的特点,采用半定量RT-PCR对CTSD基因在猪10个组织中的表达进行研究,结果表明在10个组织中均有表达,且表达量与β-actin内参接近.