牛支原体临洮分离株NOX-1的克隆表达、酶学活性及其亚细胞定位研究

摘要

为研究牛支原体(M.bovis)临洮分离株(LT strain)NOX-1基因特征表达产物的酶活性,及其在细胞中的具体存在部位,参照GenBank中M.bovis NOX-1HuBei株NOX-1基因序列(GenBank登录号:NC_015725.1)设计引物,应用PCR扩增M.bovis临洮株的NOX-1基因,在完成测序后构建NOX-1基因原核表达载体pET-NOX-1,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达.表达产物纯化后进行酶活测定并免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,继而应用Western blot及间接ELISA对NOX-1在M.bovis内的分布进行初步定位.结果显示,M.bovis临洮株NOX-1基因全长1365 bp,重组质粒经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,重组蛋白His-NOX-1的分子量约为50 kDa;重组蛋白酶促反应最适酶促温度为30℃、pH为7.5,双倒数法求得重组蛋白Km和Vmax分别为256.41μmol/L、34.25μmol/(L?min);Western blot及间接ELISA结果表明His-NOX-1在M.bovis细胞膜上和细胞浆中均有分布且胞浆含量较高.本研究结果为进一步研究M.bovis NOX-1的生物学功能奠定了一定的基础.