氢气通过调节HO-1和HMGB1的释放对严重脓毒症小鼠肠损伤起保护作用

摘要

目的探讨核因子E2相关因子2(Nrf2)通过调控血红素加氧酶-1(HO-1)/高迁移率族蛋白B1(HMGB1)通路在氢气(H_(2))治疗脓毒症小鼠肠损伤中的保护作用及机制。方法选择6~8周龄雄性野生型(WT)和Nrf2基因敲除型(Nrf2-KO)ICR小鼠各140只,体重20~25 g。按随机数字表法分别将WT小鼠及Nrf2-KO小鼠分为假手术组(Sham组)、H_(2)对照组(Sham+H_(2)组)、盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症模型组(CLP组)及H_(2)治疗组(CLP+H_(2)组),每组35只。其中Sham+H_(2)组及CLP+H_(2)组分别于术后1 h及6 h各吸入2%H_(2)60 min,Sham组和CLP组仅吸入空气。每组取20只小鼠观察术后7 d存活情况;剩余小鼠于术后24 h处死,收集腹腔灌洗液(PLF)测量细菌菌落数从而确定细菌负荷,用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测肠组织中HO-1及HMGB1蛋白表达;用免疫组化法测定肠组织HO-1表达,用免疫荧光法测定肠组织HMGB1表达。结果WT脓毒症小鼠及Nrf2-KO脓毒症小鼠7 d存活率均为0;在WT小鼠中,CLP+H_(2)组术后7 d存活率较CLP组明显升高(45%比0%,P<0.05),而在Nrf2-KO小鼠中,CLP+H_(2)组术后7 d存活率与CLP组比较差异无统计学意义(0%比0%,P>0.05)。与Sham组比较,WT及Nrf2-KO脓毒症小鼠PLF中细菌菌落数均显著增加。与CLP组相比,2%H_(2)处理能显著提高WT脓毒症小鼠的细菌清除率〔菌落数(CFU,×10^(3)):34.7±6.3比74.2±8.1,P<0.01〕,但对Nrf2-KO脓毒症小鼠无显著影响〔菌落数(CFU,×10^(3)):73.3±7.5比75.8±8.6,P>0.05〕。Western blotting、免疫组化或免疫荧光结果显示,与Sham组相比,WT和Nrf2-KO脓毒症小鼠肠组织HO-1及HMGB1表达均明显升高。与CLP组比较,2%H_(2)处理后WT脓毒症小鼠HO-1表达进一步升高〔HO-1蛋白表达(HO-1/β-actin):0.716±0.035比0.460±0.045,HO-1阳性表达(积分A值):0.703±0.135比0.430±0.116,均P<0.01〕,HMGB1表达明显降低〔HMGB1蛋白表达(HMGB1/β-actin):0.052±0.038比0.082±0.008,HMGB1阳性表达(积分A值):24.530±9.317比41.830±2.458,均P<0.01〕;而经2%H_(2)处理后的Nrf2-KO小鼠HO-1及HMGB1表达无明显变化〔HO-1蛋白表达(HO-1/β-actin):0.148±0.004比0.164±0.043,HO-1阳性表达(积分A值):0.109±0.020比0.113±0.025,HMGB1蛋白表达(HMGB1/β-actin):0.109±0.020比0.113±0.025,HMGB1阳性表达(积分A值):39.570±12.660比42.790±9.680,均P>0.05〕。结论H_(2)可经Nrf2/HO-1/HMGB1途径抑制脓毒症小鼠肠损伤,Nrf2在H_(2)治疗脓毒症肠损伤过程中起主要作用。