小窝蛋白-1脚手架区结构域多肽对脂多糖诱导肺泡巨噬细胞血红素加氧酶-1活性增加及M1/M2表型极化的影响

摘要

目的探讨小窝蛋白-1脚手架区结构域（CSD）多肽对脂多糖（LPS）诱导肺泡巨噬细胞（AMs）血红素加氧酶-1 （HO-1）活性增加和M1/M2表型极化的影响。方法应用生物信息学方法分析全长野生型CSD多肽和101位氨基酸缺失的截短型突变CSD多肽（△101CSD）与HO-1的结合情况。分离纯化培养大鼠原代AMs,细胞融合达到80%时用无血清培养基进行同步化处理,并分为5组:空白对照组不予任何处理;LPS组加入100μg/L的LPS处理16 h; LPS+血晶素组加入100μg/L的LPS和20μmol/L血晶素处理16 h;野生型CSD多肽+LPS+血晶素组在LPS处理前6 h加入10μmol/L野生型CSD多肽预处理;△101CSD+LPS+血晶素组在LPS处理前6 h加入10μmol/L△101CSD预处理。各组处理16 h后,激光共聚焦显微镜下观察AMs细胞膜小窝蛋白-1 （Cav-1）与HO-1的结合情况;采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）以及AMs的M1型标志物肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和M2型标志物白细胞分化抗原206（CD206）、IL-10的mRNA表达;采用分光光度计检测HO-1活性及一氧化氮（NO）含量。结果生物信息学分析结果显示:野生型CSD和△101CSD多肽均能与HO-1结合,且二者结合能力无明显差异;但101位Arg缺失导致△101CSD多肽与HO-1的部分结合区域消失。激光共聚焦显微镜下观察结果显示:空白对照组Cav-1和HO-1均低表达;LPS组和LPS+血晶素组Cav-1与HO-1大量结合;野生型CSD和△101CSD多肽均能明显减少LPS诱导的HO-1与Cav-1结合。HO-1活性分析结果显示:给予LPS刺激后,HO-1活性较空白对照组明显升高;血晶素可促进LPS诱导HO-1活性升高;给予两种CSD多肽预处理后,HO-1活性均进一步升高,以野生型CSD多肽作用更加显著,与LPS+血晶素组比较差异有统计学意义(pmol·mg-1·h-1:3 683±266比2 408±132,P＜0.05)。RT-qPCR检测结果显示:LPS可诱导细胞炎性因子及M1型标志物水平升高,M2型标志物水平下降;而血晶素可抑制LPS诱导的炎症反应及M1/M2表型极化。与LPS+血晶素组相比,给予野生型CSD多肽预处理后,AMs中炎性因子水平降低,同时可降低M1型标志物TNF-α和iNOS的mRNA表达水平[TNF-αmRNA(2-△△Ct):6.82±0.05比8.70±0.24,iNOS mRNA(2-△△Ct):331.50±32.05比506.70±0.10,均P＜0.05],增加M1型标志物IL-10 mRNA的表达水平(2-△△Ct):269.09±6.54比119.05±3.30, P＜0.05);而101位缺失部分削弱了CSD多肽对炎性因子的抑制作用,且只能降低iNOS mRNA的表达水平(2-△△Ct):429.11±8.92比506.70±0.10, P＜0.05),说明其促使AMs由M1表型向M2表型转化的能力较差。两种多肽对CD206的表达均无影响。结论野生型CSD多肽可减少LPS诱导的Cav-1与HO-1结合、增加HO-1活性,促进AMs由M1表型向M2表型转化,抑制促炎因子表达。