基于酶反应动力学理论优化脂肪酶活力测定体系

摘要

为了提高棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)法测定脂肪酶活力的灵敏度和准确度,以来源于Rhizopus oryzae的脂肪酶Lipase F-AP 15为研究对象,首先对其最适反应pH和反应温度进行优化,然后将表面活性剂作为激活因子引入酶活力测定体系,探究影响机制,并依据酶反应动力学理论优化测定条件(底物浓度、酶质量浓度、反应时间),对优化的p-NPP法的重复性和准确性进行了检验,最后以另一个来源的脂肪酶Lipase-PPL为模型,以同样思路与方法改进与优化其酶活力测定体系,以考察优化方法和思路的适用性。结果表明:表面活性剂PEG 8000的引入使得覆盖在脂肪酶活性位点的α-螺旋结构被重排而打开,脂肪酶由封闭构象转为并保持在活化构象,脂肪酶活性增强;优化测定体系的最适条件为pH 8.0、反应温度30℃、酶质量浓度1.00 mg/mL、底物浓度6 mmol/L、反应时间5 min,在此条件下测得的酶活力是常用p-NPP法(pH 8.0、反应温度30℃、酶质量浓度2.50 mg/mL、底物浓度10 mmol/L、反应时间8 min)测得酶活力的1.4倍;重复性和准确性试验显示,优化p-NPP法重复测定结果的相对标准偏差为1.21%,加标回收率为95.60%,均优于常用p-NPP法;优化方法和思路适用于其他来源的脂肪酶活力测定体系的优化。综上,通过将表面活性剂引入p-NPP法的脂肪酶活力测定体系,以酶反应动力学理论为指导优化测定条件,明显提高了方法的灵敏度,并有效保证了测定结果的重复性和准确性,缩短了检测时间,节省了检测成本。