白细胞抗原糖基化位点突变质粒载体构建及表达

摘要

目的 构建白细胞抗原C(HLA-C)基因糖基化位点突变质粒,初步探讨HLA-C分子糖基化修饰对HLA-C功能的影响.方法 利用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出HLA-C基因以及HLA-C糖基化位点突变基因,回收后的基因经双酶切后连接到PCMV-Flag真核表达载体上,构建成功的质粒转染进人胚肾细胞(293T)表达HLA-C蛋白以及糖基化突变HLA-C蛋白,并用蛋白免疫印迹方法进行鉴定.将鉴定正确的HLA-C和HLA-C糖基化位点突变的基因连接到带有红色荧光的载体上,并转染进293T细胞,进行免疫荧光实验,观察蛋白在细胞中表达情况.结果 琼脂糖凝胶电泳显示,成功扩增出HLA-C基因和HLA-C突变基因;蛋白免疫印迹结果显示成功表达HLA-C蛋白和HLA-C糖基化突变的蛋白;激光共聚焦结果显示,正常的HLA-C蛋白主要表达在胞质和膜周,而糖基化突变后,HLA-C大部分表达在胞质中.结论 成功构建HLA-C质粒以及糖基化位点突变的质粒载体.本实验结果为进一步研究HLA-C类分子糖基化修饰提供了基础和思路.