鸭坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

摘要

为建立鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法,对DTMUV的NS5基因设计特异性引物和MGB探针,使用RT-PCR扩增NS5基因并将其连接到pEASY?-T1载体上构建重组质粒,提取阳性重组质粒作为qRT-PCR阳性模板绘制标准曲线,用SYBR Green I法检测MGB探针法qRT-PCR的引物是否有非特异性扩增,并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样品检测.结果显示:MGB探针法qRT-PCR标准曲线的相关系数为0.9993,其引物没有非特异性扩增;对于其他阳性样本,如鸭肝炎病毒(DHV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)等抗原无扩增曲线,只能检出DTMUV;qRT-PCR敏感性可达3×102 copies/μL,是普通RT-PCR的10000倍;批内和批间重复性试验变异系数(CV)为0.08％～0.49％,均小于0.5％.从云南省不同地区采集20份临床出现产蛋下降症状的病鸭组织,应用试验建立的qRT-PCR方法检出12份阳性样品,而普通RT-PCR检出10份,两者的阳性率分别为60％(12/20)和50％(10/20).结果表明,本试验成功建立了基于DTMUV NS5基因的MGB探针qRT-PCR检测方法,其标准曲线线性关系显著,特异性强,与其他禽源性病原无交叉反应性,敏感性和重复性良好,敏感性和阳性检出率较普通RT-PCR高,更适合于DTMUV感染的临床诊断和流行病学调查.