非经典型自噬替代经典型自噬影响单核-巨噬细胞分化的研究

摘要

目的:研究经典型自噬缺失时,非经典型自噬是否在小鼠单核-巨噬细胞分化中起作用。方法:将Atg7小鼠与Lyz-Cre小鼠杂交获得单核巨噬细胞自噬特异性敲除的小鼠模型Atg7f/f;Lyz-Cre小鼠,使用C57BL/6小鼠作为对照组。应用磁珠分选的方法富集单核细胞并加因子诱导分化,流式细胞术检测单核-巨噬分化比例(Ly6C-F4/80)及细胞凋亡比例;实时荧光定量PCR方法检测非经典型自噬关键基因Vps34,Beclin1和ULK1 mRNA表达水平;Western Blot方法检测Vps34,beclin1,ULK1以及非经典型自噬关键蛋白Rab9的蛋白表达水平;使用非经典型自噬抑制剂Brefeldin A(BFA)处理单核细胞,流式细胞术检测单核-巨噬分化比例;使用共聚焦显微镜及电镜观察自噬情况。结果:与野生型小鼠相比,Atg7f/f;Lyz-Cre小鼠单核-巨噬细胞分化能力明显降低,凋亡比率显著上升(P均<0.05)。共聚焦及电镜结果显示Atg7f/f;Lyz-Cre小鼠经典型自噬被破坏,但仍存在自噬响应。而非经典型自噬关键子Vps34,Beclin1,ULK1及Rab9蛋白表达水平均上调(P均<0.05)。非经典型自噬抑制剂BFA能抑制Atg7f/f;Lyz-Cre小鼠单核-巨噬分化但不影响野生型小鼠。结论:经典型自噬对小鼠单核-巨噬细胞分化起重要作用,而当其被破坏时,非经典型自噬活性上调以维持单核-巨噬细胞分化。