多西紫杉醇诱导的多倍体非小细胞肺癌A549细胞增殖及凋亡特性研究

摘要

目的探讨多西紫杉醇（Doc）诱导的多倍体非小细胞肺癌细胞模型的增殖及凋亡特性, 分析多倍体肿瘤细胞在化疗耐药及肿瘤复发中的潜在作用。方法使用二甲基亚砜（DMSO）或1 μmol/L Doc处理非小细胞肺癌A549细胞24 h, 撤除药物后继续在完全培养液中培养至第3天或第5天, 分别记为对照组、Doc 24 h组、Doc 24 h+3 d组、Doc 24 h+5 d组。免疫荧光染色法检测细胞形态, 流式细胞术检测细胞倍性和细胞周期, Dil标记法、CFSE标记法检测细胞增殖状况, Annexin-V/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡情况, 蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白及凋亡蛋白变化。结果免疫荧光染色结果显示, 与对照组相比, Doc 24 h组小部分存活细胞的体积略有增大, 细胞呈多核状态;Doc 24 h+3 d组和Doc 24 h+5 d组细胞体积继续增大, 细胞核仍呈多核状态。细胞倍性分析结果显示, 对照组多倍体细胞亚群比例为（3.40±0.95）%, Doc 24 h组为（20.80±2.87）%, Doc 24 h+3 d组为（55.67±3.85）%, Doc 24 h+5 d组为（76.20±2.51）%, 随着撤药时间的延长, 多倍体细胞亚群比例增高, 差异具有统计学意义（F=478.054, P＆0.05）。Doc 24 h组G1期、S期细胞亚群比例低于对照组, G2/M期细胞亚群比例高于对照组, 差异均具有统计学意义（均P＆0.05）。对照组、Doc 24 h组、Doc 24 h+3 d组、Doc 24 h+5 d组细胞中cdc2、P-cdc2（Thr14）、P-cdc2（Tyr15）、P-cyclin B1（Ser128）、P-cyclin B1（Ser147）蛋白表达水平依次下调, cyclin B1蛋白表达水平依次上调, cdc25c蛋白在Doc 24 h+3 d组、Doc 24 h+5 d组中表达水平下调。Dil染色结果显示, Doc 24 h组、Doc 24 h+3 d组、Doc 24 h+5 d组细胞标记的Dil荧光均未明显减弱。CFSE染色结果显示, 随着撤药时间的延长, 多倍体A549细胞标记的CFSE的荧光强度未发生明显改变。Annexin-V/PI双染色流式细胞术检测结果显示, 与对照组相比, Doc 24 h组凋亡细胞亚群比例升高（P＆0.05）, Doc 24 h+3 d组和Doc 24 h+5 d组凋亡细胞亚群比例较Doc 24 h组降低（均P＆0.05）, 但与对照组比较差异无统计学意义（P＆0.05）。蛋白质印迹法检测结果显示, 对照组、Doc 24 h组、Doc 24 h+3 d组、Doc 24 h+5 d组细胞中抗凋亡蛋白bcl-xl和mcl-1表达依次上调, Doc 24 h组、Doc 24 h+3 d组细胞中促凋亡蛋白bax和bak表达上调, 但在Doc 24 h+5 d组细胞中表达下调。结论 Doc体外能够诱导非小细胞肺癌A549细胞多倍体的形成;可使A549细胞周期阻滞在G2/M期;Doc作用后, A549细胞增殖能力明显降低, 细胞凋亡能力增强, 但随着撤药时间延长, 凋亡抵抗发生, 相应的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达水平变化显著。这些特性可能有助于多倍体肿瘤细胞产生化疗干预后的耐药性及肿瘤复发。