水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的原核表达、抗体制备和应用

摘要

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(caffeoyl coenzyme A-O-methyltransferase,CCoAOMT)在植物木质素生物合成过程中发挥重要作用。目前关于水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的研究主要集中在基因水平,对其在蛋白水平上的功能研究却相当少。通过PCR扩增技术克隆得到OsCCoAOMT1基因,并成功构建了原核表达载体pET30a(+)-OsCCoAOMT1,转化大肠杆菌,表达出了重组蛋白。蛋白经纯化后,注射新西兰公兔,成功制备了多克隆抗体。Western blot检测表明该抗体能特异性地结合水稻不同组织的该蛋白。利用制备的抗体对水稻茎原生质体进行免疫荧光标记,激光共聚焦显微镜观察发现在Ubi:OsCCoAOMT1-GFP转基因水稻和野生型水稻原生质体里均可标记到该蛋白的信号,且转基因水稻融合蛋白的GFP信号可以与该蛋白抗体的荧光信号共定位,同时结合水稻核质蛋白分离的Western blot检测结果可知OsCCoAOMT1蛋白在主要分布在细胞质中。表明制备的抗体能用于该蛋白的特异性检测,为后续对水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的功能研究奠定了良好基础。