CRISP R/Cas9介导下敲除KNDC1的人脐静脉内皮细胞具有抗衰老能力

摘要

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的KNDC1并观察其抗衰老能力.方法 通过在线软件设计靶向于KNDC1外显子1、2、3的5个sgRNAs,并将其构建到CRISPR/Cas9载体中;经测序确认序列正确后,将重组质粒转染HeLa细胞和HUVECs,48 h后用real-time PCR和Western blot分别检测KNDC1 mRNA和蛋白表达水平;用SA-β-gal染色检测细胞衰老情况;用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧水平.结果 测序结果显示,设计的5个sgRNAs全部插入到了CRISPR/Cas9载体中,序列正确,构建成功.将5个重组质粒转染到HeLa细胞后发现第4和5号载体敲除效率较高,接下来将4和5号重组质粒转染到HUVECs中,发现与转染对照质粒相比,转染了4和5号重组质粒的HUVECs KNDC1 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05),衰老HUVECs数量和细胞内活性氧水平明显减少.结论 利用CRISPR/Cas9技术能有效敲除HUVECs的KNDC1,敲除KNDC1的HUVECs具有抗衰老能力.