敲低和敲除OPTN基因SKOV3细胞的构建及其对抗癌药物敏感性的影响

摘要

目的 利用RNA干扰技术建立稳定敲低OPTN蛋白的人SKOV3细胞株和利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立稳定敲除OPTN蛋白的人SKOV3细胞株,并研究降低OPTN基因表达对细胞抗癌药物敏感性的影响.方法 针对OPTN基因设计shRNA和sgRNA的序列,并与慢病毒载体质粒pGPU 6_GFP_Neo和敲除质粒PX 459载体连接产生重组载体.并将重组的质粒测序验证,将测序成功的重组质粒载体与包装质粒(psPAX 2、pMD 2.G)共转染293 T细胞进行病毒包装,收集病毒上清液并感染SKOV3细胞,获得稳定敲低和稳定敲除OPTN基因的SKOV3细胞株.RT-PCR检测敲低组OPTN基因的表达的变化,PCR检测敲除组的基因组DNA的变化,Western blot法分析检测OPTN蛋白的表达情况.MTT法检测DDP对卵巢癌细胞增殖的影响,qRT-PCR检测caspase3、Bax、Bcl-2的mRNA的表达情况,Western blot检测caspase3、Bax、和Bcl-2蛋白的表达情况.结果 成功构建慢病毒载体和基因敲除载体,在SKOV3细胞中的OPTN蛋白表达降低(敲减细胞株)或完全敲除(敲除细胞株).OPTN基因被敲减和敲除的卵巢癌细胞(SKOV3)对顺铂(DDP)的敏感性降低;与对照组相比,DDP对细胞抑制率降低(P＜0.05,P＜0.01),基因敲除的细胞效果更好.通过qRT-PCR和Western blot检测稳定敲减和敲除OPTN蛋白的SKOV3细胞其凋亡相关基因caspase3、Bax的mRNA和蛋白的表达量降低,而Bcl-2的表达量上升(P ＜0.05,P＜0.01).结论 在卵巢癌中降低或去除OPTN基因表达,能够降低卵巢癌细胞对抗癌药物DDP的敏感性,OPTN可能通过影响凋亡相关途径实现的.