敲除CLCA2基因对宫颈癌Siha细胞侵袭的影响及对紫杉醇药物敏感性的相关研究

摘要

目的：宫颈癌是中国妇女最常见的恶性肿瘤，也是全世界导致妇女死亡的最主要恶性肿瘤之一，严重危害着妇女的健康。肿瘤的药物耐药、侵袭和转移、术后复发是晚期宫颈癌患者常见的死亡原因，同时也是影响患者治疗和临床预后的重要因素。尽管晚期宫颈癌患者不能够得到彻底的治愈，但有很多治疗方式可以提高患者的生命长度和质量。近年来，精准医学在的癌症治疗中的迅速发展以及对肿瘤生物学理解的逐渐加深为寻找治疗癌症的新方法提供了新的方向。CLCA2已被证实是p53基因的靶基因之一，其在调控细胞增殖、迁移，肿瘤细胞浸润中起着重要的作用，目前发现其与多种肿瘤侵袭和转移的发生关系密切，但其在宫颈癌中的作用尚不清楚，实验组在前期的研究中通过应用基因芯片技术来研究异紫堇碱（Isocorydine）作用于宫颈癌SiHa细胞后基因谱的变化时发现了CLCA2基因在异紫堇碱作用48h后明显上调。因此，本实验旨在研究CLCA2基因在宫颈癌中的作用及其可能的机制，并初步探讨CLCA2对临床常用化疗药物紫杉醇的敏感性，以期对宫颈癌的诊治及预防提供一定的实验依据。
　　方法：构建特异性CLCA2-shRNA，并借助慢病毒载体将其转入宫颈癌Siha细胞中，实验分为Siha组(空白对照组)、Siha-NC组(阴性对照组)、CLCA2-shRNA-1组(CLCA2-shRNA-1转染的宫颈癌Siha细胞，下文以K1组表示)和CLCA2-shRNA-2组(CLCA2-shRNA-2转染的宫颈癌Siha细胞，下文以K2表示)，采用Western blot验证CLCA2基因的敲除效率，随后采用Transwell侵袭实验观察敲除CLCA2基因的宫颈癌Siha细胞侵袭力的变化，并用Western blot检测各组细胞上皮-间质转化标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）及波形蛋白(Vimentin)的表达水平，并检测基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase9,MMP-9)的表达。最后，利用MTS实验初步探讨敲除CLCA2基因的宫颈癌Siha细胞对紫杉醇的药物敏感性。
　　结果：1、.成功构建了慢病毒表达载体并且能够高效转入宫颈癌Siha细胞内。Western blot检测显示：与Siha组和Siha-NC组相比，K1组和K2组中CLCA2蛋白的表达水平明显下降(P＜0.05)；2、Transwell侵袭实验显示：与Siha组和Siha-NC组相比，K1组和K2组侵袭至Transwell孔下室的细胞数量明显增多，敲除CLCA2基因的细胞的侵袭力明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；3、Western blot检测显K1和K2组中的E-cadherin蛋白的表达较Siha组和Siha-NC组均显著下降，差异具有统计学意义(p＜0.05)，而Vimentin蛋白的表达K1组仅与Siha组相比明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.05），而与Siha-NC组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），K2组较Siha组和Siha-NC组均明显升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)；4、Western blot的进一步检测显示K1组和K2组中MMP-2蛋白和MMP-9蛋白的表达较Siha组和Siha-NC组均显著升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)；5.MTS实验结果显示：与Siha组和Siha-NC组相比，K1和K2组在不同浓度的紫杉醇（0.5,1,1.5,2,3,4,5nmol/l）作用下的抑制率明显增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：1、CLCA2基因的敲除能够增强宫颈癌Siha细胞的侵袭能力；2、CLCA2基因的敲除能够促进宫颈癌Siha细胞上皮-间质的转化；3、CLCA2基因的敲除后能够通过促进MMP-2和MMP-9的表达来增强肿瘤细胞的侵袭能力；4、CLCA2基因的敲除能够增强紫杉醇对宫颈癌Siha细胞的敏感性。

目录

声明

缩略词

第一章 前言

1.1宫颈癌的流行病学特征

1.2上皮-间质转化

1.3钙激活氯离子通道（CLCA）简介

1.4宫颈癌的治疗方式及面临的问题

1.5本实验的研究方法、目的及意义

第二章 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 结果

3.1 CLCA2-shRNA-LV成功转入到了宫颈癌Siha细胞中

3.2 敲除CLCA2基因能够促进宫颈癌Siha细胞的侵袭能力

3.3蛋白印迹法检测CLCA2基因的敲除对宫颈癌Siha细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响

3.4蛋白印迹法检测CLCA2基因的敲除对宫颈癌Siha细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响

3.5 MTS实验检测紫杉醇对宫颈癌Siha细胞及敲除CLCA2基因的宫颈癌Siha细胞的抑制率

第四章 讨论

第五章 结论

5.1 主要结论

5.2 研究展望

研究的创新性

研究的局限性

参考文献

综述:上皮-间质转化与肿瘤侵袭和转移的研究进展

在学期间研究成果

致谢