金铁锁鲨烯合酶cDNA的克隆和功能鉴定

摘要

濒危药用植物金铁锁(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu.)的有效成分三萜总皂苷有显著的药理活性.为克隆和鉴定金铁锁三萜皂苷生物合成途径中的关键酶基因--鲨烯合酶的全长cDNA,本研究采用同源兼并引物PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆了其全长cDNA;结合大肠杆菌异源表达、体外酶促反应及针对产物化学结构的GC和GC-MS分析等方法鉴定了其功能.研究结果表明:金铁锁鲨烯合酶cDNA全长为1 663 bp,含有1 245 bp的开放阅读框(ORF),编码414个氨基酸(计算分子质量为47.69 kD),5′非编码区(UTR)和3′UTR分别为260 bp和158 bp,GenBank注册号为EF585250,与三七、人参和甘草的鲨烯合酶的氨基酸序列有较高的同源性,分别为83%、 82%和82%,而与裂变酵母、白色念珠菌和人的氨基酸序列的同源性分别只有35%、 39%和47%;表达产物具有催化两分子法呢烯焦磷酸连接成鲨烯的活性.本研究克隆和鉴定了金铁锁鲨烯合酶的全长cDNA,为金铁锁次生代谢工程研究提供了重要基础.