基于RNA-Seq技术分析鼠源宿主防御肽对铜绿假单胞菌成熟生物被膜的清除作用

摘要

[目的]利用RNA-Seq技术探究修饰后的鼠源宿主防御肽CRAMP对铜绿假单胞菌PAO1成熟生物被膜的影响.[方法]采用结晶紫法检测生物被膜量,激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察生物被膜形态学变化;利用Illumina二代高通量测序平台,采用PE150测序策略分析了CRAMP修饰肽干预PAO1生物被膜与对照组在转录水平的基因表达差异;利用1,3-萘二酚方法测定了PAO1生物被膜中藻酸盐含量.[结果]CRAMP修饰肽能显著减少PAO1成熟生物被膜量,并且在0.98-62.50 μg/mL范围内呈一定浓度依赖性,CLSM显示CRAMP修饰肽能够显著减少细菌总荧光强度.转录组测序获得了12636700段干净读对,共鉴定出1582个差异基因,发现800个基因表达上调,782个基因表达下调.GO功能富集分析显示,1226个基因比对到GO功能分析数据库,在这些差异表达基因中,与分子功能、生物过程和细胞组成有关.KEGG通路富集分析显示,有603个表达差异显著基因比对到KEGG中的96条代谢途径,其中主要是各类氨基酸代谢途径、脂肪酸代谢途径、三羧酸循环、生物被膜调控系统等.分析发现CRAMP修饰肽可能作用于PAO1 c-di-GMP系统,增强细菌运动性和生物被膜分散,并且与其密度感应(quorum sensing,QS)系统和藻酸盐合成相关.最后经验证,CRAMP修饰肽显著减少了PAO1成熟生物被膜中藻酸盐的含量.[结论]CRAMP修饰肽对PAO1成熟生物被膜具有明显的清除作用,且能导致成熟生物被膜藻酸盐含量下降.通过转录组数据分析,可能是由于CRAMP修饰肽使PAO1 c-di-GMP水平下调导致的,具体机制还有待进一步探究.