基于PHA颗粒-PhaP标签和内含肽元件的极端嗜盐古菌蛋白的表达纯化系统

摘要

[目的]建立一个基于PHA颗粒-PhaP标签的简便实用的极端嗜盐古菌蛋白表达纯化系统,并探讨嗜盐古菌内含肽在该系统优化中的应用.[方法]以嗜盐古菌-大肠杆菌穿梭载体pWL502为基本骨架,构建带有嗜盐古菌强启动子和PhaP融合标签的表达载体;在地中海富盐菌phaP缺陷株(△phaP)中融合表达目的基因,通过蔗糖密度梯度离心分离纯化结合于PHA颗粒上的PhaP融合蛋白;在phaP基因与多克隆位点之间引入特定的嗜盐古菌内含肽元件,尝试通过定点突变改变该内含肽的剪切活性.[结果]成功构建了以PhaP作为N端融合标签的表达载体pPM以及作为C端融合标签的载体pIP;在phaP基因簇强启动子控制下,二者均实现了目标蛋白的高效表达;通过PHA颗粒介导的蛋白分离纯化策略,实现了以PhaP为融合标签的目标蛋白的分离纯化;发现内含肽序列Hbt21在地中海富盐菌中保持了高效的剪接活性,通过定点突变其C端末位氨基酸天冬酰胺(N182)及邻位的丝氨酸(S183)失活了该内含肽的C端剪接活性.[结论]首次建立了一个基于PHA颗粒-PhaP标签的简便节约的极端嗜盐古菌蛋白表达纯化系统,并确定了嗜盐古菌型内含肽C端剪接的活性位点,为该内含肽将来应用于PhaP融合蛋白的标签去除奠定了基础.