极端嗜盐古菌嗜盐菌素C8的分离纯化和基因克隆

摘要

为了进一步在蛋白和基因表达水平上对嗜盐菌素的多样性进行研究,该文对22株极端嗜盐古菌进行了产嗜盐菌素的筛选.抑菌实验发现,在22株极端嗜盐古菌中,有21株可以产生嗜盐菌素;只有1株(Halobacterium sp.QD3)不产嗜盐菌素.其中,有6个嗜盐菌素(Hal C6、Hal C8、Hacl C9、Hal C16、Hal C17、Hal C22)抑菌谱比较广,可以抑制大多数(≥10)极端嗜盐古菌的生长.对这6个嗜盐菌素分析进行理化性质的测定,发现Hal C8性质非常稳定,是研究嗜盐菌素的理想材料.根据嗜盐菌素C8的N端氨基酸序列设计了一对简并引物(C8-2,C8-4),利用这对引物从AS7092的总DNA中扩增出halC8的部分序列.将这段PCR产物克隆到T-载体上,形成质粒pLY11,测序结果表明PCR产物所编码的氨基酸是与Hal C8成熟蛋白的N端氨基酸序列是一致的.

目录

缩写表

第一章文献综述

一极端嗜盐古菌概况

1.古菌及生命的三域进化系统

2.极端嗜盐古菌及其主要类群

3.极端嗜盐古菌的主要特征

4.研究极端嗜盐古菌的生物学意义

二嗜盐菌素(halocin)

1.嗜盐菌素的发现

2.嗜盐菌素的产生及其分离纯化

3.嗜盐菌素的理化性质和可能的抑菌机制

4.嗜盐菌素基因halH4和halS8的基因结构及其克隆表达

5.总结与展望

第二章极端嗜盐古菌嗜盐菌素的筛选

1.材料和方法

1.1菌株

1.2培养基

1.3筛选方法

2.结果与讨论

2.1极端嗜盐古菌相互之间的抑制作用

2.2嗜盐菌素的理化性质

第三章嗜盐菌素C8的分离纯化及性质研究

1.材料和方法

1.1菌株和培养基

1.2蛋白浓度测定方法

1.3 TCA法沉淀总蛋白

1.4嗜盐菌素活性测定方法

1.5 AS7092生长阶段与嗜盐菌素活性之间的关系

1.6嗜盐菌素C8的生理生化性质

1.7嗜盐菌素C8的分离纯化

1.8嗜盐菌素C8的等电点测定

1.9嗜盐菌素C8对Halorubrumsaccharovorum的形态影响

2.结果和分析

2.2嗜盐菌素C8的抑菌谱

2.3嗜盐菌素C8的性质

2.4嗜盐菌素C8的纯化

2.5嗜盐菌素C8的等电点

2.6嗜盐菌素C8裂解敏感菌株Hrr.saccharovorum的电镜观察

2.7嗜盐菌素C8的N端蛋白序列

3.讨论

第四章嗜盐菌素C8的基因(halC8)克隆

1.材料

1.1菌株及质粒

1.2培养基

1.3缓冲液及试剂

2.方法

2.1 DNA提取

2.2 DNA片段的回收

2.3 DNA连接

2.4感受态细胞的制备与转化

2.5脉冲场凝胶电泳分离AS7092大质粒及基因组DNA

2.6探针标记与杂交

2.7 halC8转录起始位点的确定

3.结果

3.1基因克隆探针的设计和制备

3.2部分基因文库的构建

3.3基因文库的筛选

3.4克隆片段的酶切物理图谱分析及目的基因定位

3.5克隆片段的DNA序列测定及结构分析

3.6 halC8的基因定位

4.讨论

参考文献

总结

致谢

附：博士在读期间发表的文章