AphA蛋白促进副溶血弧菌c-di-GMP合成和生物膜形成

摘要

[目的]综合运用表型和分子生化实验研究AphA蛋白对副溶血弧菌生物膜形成的调节机制.[方法]利用菌落褶皱和结晶紫染色实验比较aphA突变株(AaphA)和野生株(WT)的表型差异;进而利用色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)的方法分别检测AaphA和WT中c-di-GMP分子含量;提取AaphA和WT的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;分别构建克隆有scrABC和scrG上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入AaphA和WT中,通过测定并比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性差异来进一步研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;PCR扩增scrABC和scrG的整个启动子区DNA序列,并纯化His-AphA蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证AphA对靶基因启动子区是否具有直接的相互作用.[结果]表型结果显示AphA能促进c-di-GMP的合成和生物膜形成;实时定量RT-PCR和LacZ结果表明AphA能抑制scrABC和scrG的转录表达;EMSA结果证明AphA不能结合到scrABC和scrG的启动子区DNA上.[结论]AphA间接抑制scrABC和scrG的表达是其促进副溶血弧菌c-di-GMP合成及生物膜形成的机制之一.