副溶血弧菌转录因子AphA调控生物膜基因的初步研究

摘要

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，简称VP）是一种嗜盐性革兰氏阴性致病菌，人们若食用了被VP菌污染的生的或未煮熟的食物后可能会引起发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状。VP菌可以游离于海水环境，也可以在固相表面形成生物膜，生物膜是其适应不利环境而采取的主要生存策略，生物膜形成受环二鸟苷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)信号通路和密度感应(Quorum sensing，QS)系统的调节。VP菌在小核糖核酸RNA(Quorum-regulated small RNAs，QrrsRNAs)的参与下，调节全局调控子OpaR和AphA的表达。VP菌在高密度时，OpaR起核心调节作用;在低密度时，AphA起核心调节作用，通过表型结果显示它能促进生物膜形成和毒力因子的表达，但是其分子机制还未被阐明。
　　目的:综合运用表型与分子生化实验研究AphA蛋白对VP菌生物膜形成的调节机制。
　　方法:首先利用菌落褶皱与结晶紫染色实验比较野生株(WT)和aphA突变株（△aphA）的表型差异;进而再利用色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)的方法检测WT与△aphA各自中c-di-GMP分子的含量。
　　利用生物学软件设计AphA蛋白位于胞浆区的N-末端DNA结合域的上下游引物，扩增AphA蛋白N-末端DNA结合域，然后酶切连接到pET-28a-c(+)质粒，转化到大肠杆菌BL21(λDE3)中，通过鉴定筛选出AphA的蛋白表达株，所得菌株经IPTG诱导后，再经Ni-NTA柱纯化，最后透析浓缩得到带His标签的AphA蛋白。
　　利用生物信息学的方法，对AphA蛋白与DNA的结合基序进行预测，并筛选感兴趣的基因，通过凝胶迁移阻滞实验（Electrophoretic mobilityshift assay，EMSA）验证His-AphA蛋白对生物膜靶基因启动子区是否具有直接的相互作用。
　　利用生物学软件设计9个生物膜基因（包括胞外多糖和c-di-GMP合成的基因）的启动子区上下游引物，扩增这些毒力基因启动子区，然后酶切连接到pHRP309质粒上，转化到大肠杆菌JM109中，鉴定、测序并筛选出阳性的单克隆，提取重组质粒并转化到副溶血弧菌野生株(WT)和aphA突变株（△aphA）中，通过测定野生株(WT)和突变株（△aphA）中β-半乳糖苷酶活性的差异，研究AphA对靶基因的调控关系。
　　提取WT和△aphA的总RNA，采用实时定量RT-PCR的方法研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;
　　结果:通过表型实验结果显示AphA能促进VP菌生物膜的形成，利用色谱串联质谱的方法检测WT与△aphA各自中c-di-GMP分子的含量，结果显示AphA能促进c-di-GMP的合成;利用大肠杆菌BL21(λDE3)表达系统成功表达出了有活性的His-AphA蛋白。EMSA实验结果表明:His-AphA蛋白能特异性地结合到VP0376、VP0485和VP1469的启动子区，VPA1513(scrABC)、VP1377(scrG)、VP0117、VPA0198、VP1403和VP1476的启动子区无直接结合作用;LacZ报告基因融合实验结果显示AphA能激活VP1469和VP0485的转录表达，而对VPA1513、VP1377和VP0376具有转录抑制作用;利用实时定量RT-PCR的方法研究表明AphA抑制scrABC和scrG的转录表达。
　　结论:所表达的His-AphA蛋白可用于后续的转录调控机制研究;AphA通过直接激活VP0485、VP1469的转录表达，直接抑制VP0376的转录表达，间接抑制scrABC、scrG的转录，从而促进VP菌胞外多糖和c-di-GMP的合成，进而促进其生物膜的形成，使VP菌具有高感染性。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 副溶血弧菌生物学特性

1．1．1 形态染色

1．1．2 培养特性

1．1．3 生化反应

1．2 副溶血弧茵毒力研究概述

1．2．1 耐热直接溶血素(TDH)

1．2．2 不耐热溶血素(TLH)

1．2．3 粘附因子

1．2．4 Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，T3SS)

1．2．5 Ⅳ型分泌系统(Type Ⅳ secretion system，T6SS)

1．2．6 多种酶类

1．3 副溶血弧菌生物膜研究现状

1．3．1 鞭毛

1．3．2 四型菌毛(type Ⅳ pili)

1．3．3 多糖

1．3．4 环二鸟苷酸(c-di-GMP)

1．3．5 弧菌的密度感应(Quorum sensing，QS)系统

第2章 研究目的及意义

第3章 AphA蛋白对副溶血弧菌生物膜表型和c-di-GMP合成的影响实验

3．1 材料

3．1．1 菌株和质粒

3．1．2 酶和试剂盒

3．1．3 主要溶液的配制

3．1．4 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 细菌培养

3．2．2 菌落表面褶皱

3．2．3 生物膜结晶紫染色

3．2．4 c-di-GMP测定

3．3 结果

3．3．1 AphA蛋白影响VP菌生物膜表型

3．3．2 AphA促进c-di-GMP的合成

3．4 讨论

3．5 本章小结

第4章 副溶血弧菌AphA蛋白的DNA结合活性分析

4．1 材料

4．1．1 菌株和质粒

4．1．2 酶，试剂盒

4．1．3 药品，试剂，溶液的配制

4．1．4 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 pET-28a-c(+)质粒图谱

4．2．2 AphA蛋白的表达载体的构建

4．2．3 His-AphA蛋白的表达和纯化

4．2．4 AphA蛋白的DNA结合活性分析

4．2．5 凝胶阻滞实验(electrophoretic mobilityshift assay，EMSA)

4．3 结果

4．3．1 AphA蛋白的表达

4．3．2 AphA蛋白的DNA结合活性分析

4．3．3 凝胶阻滞实验(EMSA)

4．4 讨论

4．5 本章小结

第5章 副溶血弧菌LacZ报告基因融合实验及实时定量RT-PCR

5．1 材料

5．1．1 菌株和质粒

5．1．2 酶，试剂盒

5．1．3 药品，试剂，溶液的配制

5．1．4 主要仪器

5．2 方法

5．2．1 LacZ重组质粒构建

5．2．2 重组质粒转化入副溶血弧菌野生株和突变株

5．2．3 β-半乳糖苷酶活性检测

5．2．4 实时定量逆转录PCR(real time RT-PCR)

5．3 结果

5．3．1 LacZ报告基因融合实验结果

5．3．2 AphA抑制scrABC和scrG的转录

5．4 讨论

5．4 本章小结

第六章 结论

参考文献

英文缩略词表

致谢

攻读期间发表论著及参加科研情况