三种组成型启动子调控的鼠李糖脂基因在防御假单胞菌中的异源表达及活性研究

摘要

本研究利用Red/ET DNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因RhlAB的分泌表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰,将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了RhlAB基因在铜绿假单胞菌中的原始启动子,成功获得了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB,pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB,并将这些表达载体分别在防御假单胞菌Pf-5中异源表达,通过LB培养基发酵42 h后,Pf-5/pBBR1-genta-RhlAB的鼠李糖脂产量为17.56 mg/L,而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-Rh1AB,Pf-5/pBBR1-kan-Plac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB分别是11.135 mg/L,441.135 mg/L,557.764 mg/L,启动子优化后产量分别是原始启动子的0.63,25.12和31.76倍.对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析,共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物.并通过实时荧光定量PCR检测RhlAB基因的表达量,发现启动子替换为Ptac和PrhaB后RhIAB基因表达量分别是原始启动子的2.16和2.77倍.本研究初步实现了RhlAB基因在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Ptac和PrhaB比RhlAB的原始启动子表达效率更高,可为异源合成鼠李糖脂提供重要参考.