苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化

摘要

高效分离原生质体是遗传转化、细胞融合和再生培养的基础性工作.该实验以苦养(Fagopyrum tartaricum)品种‘榆6-21’的叶肉细胞为材料,研究了酶类组合、甘露醇浓度、酶解时间以及离心速度对苦荞叶肉细胞原生质体分离纯化的影响.结果表明:酶解液组成为1.5％纤维素酶R-10+0.5％离析酶R-10+0.5 mol/L甘露醇+20 mmol/L MES+20 mmol/l KCl+10 mmol/L CaCl2 +0.1％牛血清白蛋白,以第5～7片真叶为材料,用胶带纸撕去叶片下表皮后,25℃黑暗酶解4h,以900 r/min离心收集,可以获得高质量的原生质体,原生质体产量可达6×10 6个/g,活力达到90％以上;用双荧光素酶报告基因载体检测原生质体的转化效率,以分离纯化的苦荞叶肉细胞原生质体为受体,将双荧光素酶报告基因载体与其混合后,在终浓度为20％ PEG4000介导下,黑暗转化20 min,可以检测到较高活性的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶,证明双荧光素酶报告载体可成功转化到原生质体中.研究结果为苦荞原生质体瞬时转化及遗传操作提供了技术基础.