PEG介导玉米叶肉细胞原生质体瞬时基因转化体系的应用研究

摘要

原生质体瞬时基因表达系统以其经济、简便、快捷和高效的独特优势，用于研究植物信号转导途径、筛选信号通路途径中的功能基因以及分析功能基因的特性，已经成为一种研究植物生理、生化、分子机制的重要手段。植物原生质体具备与完整植株和组织类似的生理特性，如对植物激素、代谢物、外界环境、病原诱导的激发子的刺激能够做出相应的响应。结合遗传学，基因组学和转基因的方法，原生质体表达系统的应用为各种功能基因的高通量筛选和系统特异性分析作出了重要贡献。目前，拟南芥、烟草和番茄等双子叶植物的原生质体的应用已经很普遍，尤其是在模式植物拟南芥中，以PEG-Ca2+介导的原生质体瞬时表达系统的研究已经很成熟。不管是在信号转导和启动子的研究，还是在功能基因和amiRNA（人工miRNA）的高通量筛选方面都取得很多重要的成果。但是针对玉米和水稻这类单子叶植物的原生质体瞬时表达系统的研究还比较少。玉米不仅是一种重要的粮食作物，而且是单子叶植物研究的经典模式植物。以电激介导的玉米原生质体瞬时转化体系在信号转导、启动子和光合作用中关键酶的研究中都已经取得了许多成果。尽管化学转染方法更易操作，但是以PEG-Ca2+介导的玉米原生质体的转化方法却很少被报道。由于玉米的转基因工程存在周期长，耗材多，工作量大，得到稳定转化的植株较困难等问题，这就使玉米在功能基因如转录因子，启动子的筛选和功能研究等方面非常困难。而原生质体瞬时表达系统可以快捷，有效地筛选出植物中一些功能基因，并且分析它们的功能特性。因此，玉米原生质体瞬时基因转化技术对玉米功能基因的研究是必不可少的。我们以玉米原生质体为材料，详细阐述了玉米原生质体的提取、转化和培养方法。我们选取玉米的一个基因ZmMYC2-2，采用PEG-Ca2+介导的化学转染方法，对ZmMYC2-2进行亚细胞定位，在转录水平和次生代谢物水平对这个基因的功能进行初步分析，并且验证了玉米原生质体也可以筛选amiRNA。经研究和分析后得到以下结论：
　　（1）亚细胞定位实验显示，ZmMYC2-2只在细胞核中表达。所以推测ZmMYC2-2基因类似于拟南芥中的AtMYC2基因，可能在玉米的茉莉酸（JA）合成和信号转导中作为转录因子起重要的调控作用。
　　（2）ZmMYC2-2基因的过表达实验结果表明，与茉莉酸合成有关的OPR7和OPR8基因都有显著上调，与丁布合成有关的Bx基因也都有显著上调，与抗虫有关的丁布类次生代谢物的含量与对照相比也都显著上调。这些结果与亚细胞定位结果的功能预测相吻合。
　　（3）ZmMYC2-1和 ZmMYC2-1的人工小RNA（amiRNA）过表达实验结果表明，两个ZmMYC2的表达量与对照相比显著降低。说明我们所选择的amiRNA对各自的目的基因都有显著的沉默效果。
　　以上结果都证明PEG介导的玉米原生质体表达系统也可以作为一种重要和实用的手段来对玉米中的功能基因筛选并进行功能特性研究。尤其为玉米在转录水平和次生代谢物水平的研究提供了更为快捷、经济、简便而有效的方法。同时，也为玉米的转基因工作提供参考。

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1 文献综述

1.1原生质体瞬时表达系统的研究简史

1.2 叶肉细胞原生质体瞬时表达系统的优劣性

1.3 原生质体在玉米中的应用

1.4 sRNAs介导基因沉默

2引言

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.2主要生化试剂和仪器

3.3 常用溶液配方

3.4 实验步骤

3.5 ZmMYC2-2的克隆

3.6 ZmMYC2-2的amiRNA克隆

3.7 Q-RT-PCR鉴定表达量

3.8 高效液相色谱检测激素和次生代谢物的含量

4 结论与讨论

4.1 亚细胞定位分析

4.2 过表达ZmMYC2-2后相关基因在转录水平的表达分析

4.3过表达ZmMYC2-2后丁布类抗虫次生代谢物的含量测定

4.4 amiRNA对ZmMYC2-2的沉默效率分析

4.5全文总结

参考文献

附录A 主要生化试剂和仪器

附录B 原生质体分离液配方

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