一种PEG介导的原生质体瞬时转化方法及其专用试剂

摘要

本发明公开了一种PEG介导的原生质体瞬时转化方法及其专用试剂。本发明提供的专用试剂，由溶质和溶剂组成；所述溶质由甘露醇、Ca(NO

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种PEG介导的原生质体瞬时转化方法及其 专用试剂。

背景技术

外源基因导入植物细胞中的表达方式分为稳定表达和瞬时表达，其中瞬时表达引 入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细 胞后12小时内就可以表达，并持续约80小时左右。植物瞬时表达有简单快速、表达 水平高、安全有效等优点，在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用途广 泛。

PEG介导的转化法可将外源基因转化到植物原生质体进行瞬时表达。应用在拟南 芥、玉米等植物的PEG介导转化法已经相当完善。但应用在苹果果肉原生质体瞬时转 化的PEG介导转化法还不完善，Ratnasiri(Plant Cell，Tissue and Organ  Culture，2002)利用PEG介导法将带有GFP报告基因的目的载体转化到苹果果肉原生质 体中，检测到转化成功的原生质体，但转化效率不到10％，这大大阻碍了后续研究的 进行。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于转化的专用试剂。

本发明提供的专用试剂，由溶质和溶剂组成；

所述溶质由甘露醇、Ca(NO₃)₂和PEG4000组成，所述甘露醇、所述Ca(NO₃)₂和所述PEG4000的配比为200mmol∶0.125mmol∶0.2g-0.8g。

上述的专用试剂中，所述甘露醇在所述专用试剂中的浓度为200mM；

所述Ca(NO₃)₂在所述专用试剂中的浓度为0.125mM；

所述PEG4000在所述专用试剂中的浓度为0.2g/ml-0.8g/ml。

上述的专用试剂中，所述PEG4000在所述专用试剂中的浓度为0.6g/ml；

所述溶剂为水。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述专用试剂的方法。

本发明提供的方法，将所述溶质按照所述配比溶于所述溶剂，得到所述专用试剂。

上述专用试剂在介导外源DNA转入果肉原生质体中的应用也是本发明保护的范 围，所述果肉具体来源于苹果。

本发明的第三个目的是提供一种PEG介导的外源DNA转入果肉原生质体的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将外源DNA在上述专用试剂介导下转入果肉 原生质体。

上述方法包括如下步骤：

1)将所述外源DNA和含有果肉原生质体的悬浮液混匀，得到混合液1；

2)向所述混合液1中加入上述专用试剂混匀，静置，得到混合液2，将所述混合 液2离心收集沉淀；

3)向所述沉淀中加入介导缓冲液混匀，得到反应体系，孵育所述反应体系，以 实现外源DNA转入果肉原生质体。

上述的方法中，在反应体系中，所述外源DNA和所述含有果肉原生质体的悬浮液 中的果肉原生质体的配比为5ug-15ug∶2×10³-10×10³个；所述外源DNA和所述含有 果肉原生质体的悬浮液中的果肉原生质体的配比具体为10ug∶6×10³个；

在反应体系中，所述外源DNA和所述权利要求1-3中任一所述专用试剂中所述 PEG4000的配比为：5ug-15ug∶0.04g-0.12g，所述外源DNA和所述专用试剂中所述 PEG4000的配比具体为10ug∶0.12g。

上述的方法中，步骤1)中，所述外源DNA为质粒，所述质粒具体为pEZS-NL质 粒；

步骤2)中，所述静置时间为30min；所述离心的转速为100rpm，所述离心的时 间为1min，所述离心半径为13.5cm；

步骤3)中，所述孵育为黑暗孵育，所述孵育的时间为10-14h，所述孵育的时 间具体为12h，所述孵育的温度为24℃。

在步骤2)中的所述将所述混合液2离心收集沉淀前和得到所述混合液2的步骤间 还包括向所述混合液2加入所述介导缓冲液混匀的步骤。

上述的方法中，

步骤1)中，所述含有果肉原生质体的悬浮液为将果肉原生质体用悬浮缓冲液悬浮 得到；

所述悬浮缓冲液为将甘露醇、MgCl₂、2-N-吗啡啉乙磺酸(MES)和水混合，所述甘 露醇在所述悬浮缓冲液中的浓度为400mM，所述MgCl₂在所述悬浮缓冲液中的浓度为 15mM，所述2-N-吗啡啉乙磺酸在所述悬浮缓冲液中的浓度为4mM；

所述介导缓冲液为将NaCl、CaCl₂、KCl、葡萄糖(Glucose)、2-N-吗啡啉乙磺 酸和水混合，所述NaCl在所述介导缓冲液中的浓度为154mM；所述CaCl₂在所述 介导缓冲液中的浓度为125mM；所述KCl在所述介导缓冲液中的浓度为5mM；所 述葡萄糖在所述介导缓冲液中的浓度为5mM；所述2-N-吗啡啉乙磺酸在所述介导 缓冲液中的浓度为0.03％(质量百分含量)。

上述的方法中，所述果肉来源于苹果。

本发明的实验证明，本发明提供了一种适于转化的试剂，选择原生质体瞬时转化 的载体pEZS-NL作为外源DNA进行转化，证明本发明的试剂和方法改良了苹果果实果 肉原生质体瞬时转化体系，大大提高了原生质体瞬时转化的效率，为进一步研究苹果 果实发育、成熟过程中的分子机制奠定了良好基础。

附图说明

图1为苹果果肉原生质体GFP荧光检测图像

图2为苹果果肉原生质体数量对转化效率的影响

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

原生质体PEG介导瞬时转化的流程大致为：将原生质体稀释到一定程度-加入质 粒DNA-加入PEG4000-稀释、离心、收集、纯化原生质体-荧光检测转化效率

pEZS-NL质粒(Isolation and Characterization of the Iron-Regulated MxbHLH01 Gene in Ma1us xiaojinensis，Plant Mon Biol Rep(2011)29：936-942；Cloning and  functional analysis of the peanut iron transporter AhIRT1 during iron  deficiency stress and intercropping with maize，Journal of Plant  Physiology(2010)996-1002，公众可从中国农业大学获得)，此载体特点是携带35S启 动子驱动的GFP报告基因、Amp抗性、全长为5683bp，适合PEG介导的原生质体瞬时 转化实验。载体详细信息可由以下网址查询到： http://deepgreen.stanford.edu/cell％20imaging％20site％20/data％20media/vector  s％20media/pEZSNLseq.txt

使用的Marker购自Takara公司；去内毒素质粒提取试剂盒购自Promega公司； 其他常规生化试剂和试剂盒购自北京经科宏达生物技术公司和北京欣经科生物技术公 司。所述的琼脂糖凝胶电泳使用UVP Gel Documentation凝胶分析系统，购自基因公 司；所述的琼脂糖凝胶电泳使用DYCP-31DN电泳仪，购自北京六一仪器公司。

本实验中所述基本操作方法可以参考《分子克隆实验指南第三版》中((美)J. 萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)和《植物基因工程原理与技术》中(王 关林，方宏筠著，科学出版社，1998)。

本实验中，荧光显微镜型号为奥林巴斯SZ61GFP-D，PEG4000购于Fluka(#81240)， 其他常规生化试剂购自北京经科宏达生物技术公司和北京欣经科生物技术公司。离心 管等一般耗材购于Axygen公司。

实施例1、原生质体PEG介导瞬时转化

一、转化材料的制备

质粒DNA的准备：将pEZS-NL质粒转化进入DH5α大肠杆菌感受态，涂板、挑斑、 摇菌，利用去内毒素质粒提取试剂盒将扩繁后的pEZS-NL质粒提取出来，-20℃保存备 用，得到待转pEZS-NL质粒。

游离的苹果果肉原生质体：先用酶溶液酶解3小时金冠苹果近果心1-2cm果肉， 得到酶解产物；再用孔径具体为50um的尼龙网过滤酶解产物，再用洗涤溶液洗涤过滤 后的尼龙网，收集洗液，200rpm离心(离心半径为13.5cm)10min、悬浮，得到游离 的苹果果肉原生质体。

上述酶溶液的配方如下：纤维素酶R10 0.5％(质量百分含量)、离析酶R10 0.3％ (质量百分含量)、甘露醇400mM、MES(2-N-吗啡啉乙磺酸，Amresco，E169)10mM、 抗坏血酸5.7mM、CaCl₂ 5mM、BSA 0.1％(质量百分含量)和水，pH＝5.7。

具体按照如下方法制备：

纤维素酶R10：0.5％(质量百分含量)

离析酶R10：0.3％(质量百分含量)

甘露醇：400mM

MES(2-N-吗啡啉乙磺酸，Amresco，E169)：10mM

将上述各组分混匀，55℃加热10min，冷却至室温(25℃)分别加入以下成分：

抗坏血酸：5.7mM

CaCl₂：5mM

用0.45um滤膜抽滤灭菌

再加入0.1％(质量百分含量)的BSA，用Na0H调节pH＝5.7，得到酶溶液。

洗涤溶液液配方为NaCl 120mM、CaCl₂ 120mM、KCl 3mM、MES 2mM；

悬浮液配方：将甘露醇、MgCl₂、MES和水混合，得到悬浮液，甘露醇在悬浮液中的 浓度为400mM，MgCl₂在悬浮液中的浓度为15mM，MES在悬浮液中的浓度为4mM。

上述纤维素酶R10(目录号为110921-01)和离析酶R10(目录号为202050)均 购于Yakult Honsha。

二、转化体系各成分浓度梯度的摸索(操作环境为24℃)

1、不同浓度质粒DNA与不同浓度PEG4000体系下原生质体的转化

1)将200ul上述一制备的游离的苹果果肉原生质体用显微镜观察估计数量。

2)、取5ug、10ug、15ug上述一得到的质粒DNA于1.5ml EP管中，加入100ul(约 5×10³个)苹果果肉原生质体，用剪去尖端的200ul黄枪头轻轻混匀。

3)、分别加入200ul PEG4000/Ca溶液1-4，轻轻混匀，静置30min。

PEG4000/Ca溶液1的配方：将甘露醇、Ca(NO₃)₂、PEG4000和ddH₂O混合，得到 PEG4000/Ca溶液，甘露醇在溶液中的终浓度为200mM，Ca(NO₃)₂在溶液中的终浓度 为0.125mM，PEG4000在溶液中的终浓度分别为0.2g/ml。

PEG4000/Ca溶液2的配方：将甘露醇、Ca(NO₃)₂、PEG4000和ddH₂O混合，得到 PEG4000/Ca溶液，甘露醇在溶液中的终浓度为200mM，Ca(NO₃)₂在溶液中的终浓度 为0.125mM，PEG4000在溶液中的终浓度分别为0.4g/ml。

PEG4000/Ca溶液3的配方：将甘露醇、Ca(NO₃)₂、PEG4000和ddH₂O混合，得到 PEG4000/Ca溶液，甘露醇在溶液中的终浓度为200mM，Ca(NO₃)₂在溶液中的终浓度 为0.125mM，PEG4000在溶液中的终浓度分别为0.6g/ml。

PEG4000/Ca溶液4的配方：将甘露醇、Ca(NO₃)₂、PEG4000和ddH₂O混合，得到 PEG4000/Ca溶液，甘露醇在溶液中的终浓度为200mM，Ca(NO₃)₂在溶液中的终浓度 为0.125mM，PEG4000在溶液中的终浓度分别为0.8g/ml。

4)、加入400ul介导buffer(介导缓冲液)，轻轻颠倒混匀，100rpm离心(离心 半径13.5cm)1min。

介导buffer配方：

NaCl：154mM

CaCl₂：125mM

KCl：5mM

Glucose：5mM

MES：0.03％(质量百分含量)用水补齐体积，调节pH＝5.7

5)、弃上清液，加入100ul介导buffer，混匀，加入900ul介导buffer，轻轻混 匀。

6)、将上述混合液加入细胞培养板中，得到反应体系，黑暗孵育12h。

7)、100rpm离心2min，吸取上清使终体积为50ul，荧光观察。

在上述反应体系中，

外源DNA和PEG4000/Ca溶液1中PEG4000的配比分别为5ug-15ug：0.04g；

外源DNA和PEG4000/Ca溶液2中PEG4000的配比分别为5ug-15ug：0.08g；

外源DNA和PEG4000/Ca溶液3中PEG4000的配比分别为5ug-15ug：0.12g；

外源DNA和PEG4000/Ca溶液3中PEG4000的配比分别为5ug-15ug：0.16g；

结果如表1和图1所示，转化效率为带有GFP荧光的原生质体与总原生质体数量 的比值；

表1不同浓度质粒DNA与不同浓度PEG4000体系下原生质体的转化效率

可以看出，由于PEG4000浓度为0.8g/ml时，处理原生质体得到的碎片较多，所 以当质粒DNA为10ug，PEG4000终浓度为0.6g/ml时，原生质体转化效率较好。即外 源DNA和PEG4000/Ca溶液3中PEG4000的配比10ug∶0.12g时效率最好。

2、原生质体个数对转化效率的影响

转化体系中，在质粒DNA数目一定的情况下，原生质体的数目也是影响转化效率 的关键因素。

本实验在质粒DNA为10ug，PEG4000终浓度为0.6g/ml时，游离数目约为2×10³、 4×10³、6×10³、8×10³、10×10³的果肉原生质体，来确定转化效率较高的原生质体 数目，转化方法同上述1。

转化效率结果如表2和图2所示，

表2为不同原生质体个数的转化效率

因此，本实验的PEG介导的转化的材料参数最佳为质粒DNA为10ug，PEG4000终 浓度为0.6g/ml时，游离数目约为6×10³的苹果肉原生质体转化效率最高，可达35％。