酪氨酸硫化修饰对酪氨酸硫化转移酶活性的调节

摘要

目的 研究酪氨酸硫化修饰对酪氨酸硫化转移酶(TPST)1和TPST 2的调节作用.方法 以人cDNA为模板,采用聚合酶链反应方法扩增人TPST1和TPST2基因野生型的全长cDNA序列,并融合入人IgG1的Fc编码区域;采用定点突变方法将TPST1和TPST2蛋白中可硫化的酪氨酸突变为苯丙氨酸.针对TPST1(259～275位核苷酸)和TPST2(73～94位核苷酸)基因,分别构建小干扰RNA(shRNA)1和shRNA2重组质粒.测定所有构建质粒开放读框序列.证实序列正确后,将上述质粒分别转染人肾胚胎上皮细胞(HEK)293T. 24 h后将细胞分成3份:1份用于35S-蛋氨酸/半胱氨酸或35S-亚硫酸钠标记,48 h后再进行免疫沉淀反应;1份用于125I标记配基结合;1份用于流式细胞仪检测受体的表达水平.结果 TPST1 326位和TPST2 325位酪氨酸在翻译后被硫化修饰,这一翻译后修饰被特异性的硫化抑制剂shRNA1和shRNA2及非特异性的硫化抑制剂NaClO3显著抑制.shRNA1和shRNA2可显著抑制补体3a和5a受体的硫化,并进一步降低这两种受体与特异性配基的结合效率.结论 TPST1和TPST2翻译后受酪氨酸硫化修饰的调节,硫化抑制剂shRNA可以显著抑制TPST的活性,并进一步抑制补体3a和5a受体结合其特异性配基的作用.