人C5a受体与金黄色葡萄球菌分泌趋化抑制蛋白的相互作用以及翻译后酪氨酸硫化修饰的重要意义

摘要

目的：探讨金黄色葡萄球菌分泌的趋化抑制蛋白（CHIPs）与趋化因子C5a受体（C5aR）或促酰化蛋白受体（C5L2）的相互作用及C5aR氨基末端酪氨酸硫化修饰对其与CHIPs结合能力的影响。
　　 方法：
　　 1.提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213的基因组DNA，设计引物体外扩增趋化抑制蛋白编码基因chp，重组CHIPs表达载体，原核表达并纯化CHIPs蛋白，测定纯化样品的浓度。
　　 2.外周血提取RNA并逆转录，设计引物体外扩增C3αR，C5αR，C5L2，CXCR3和PTAFR，分别表达于HEK293T细胞上并通过western blot进行鉴定。
　　 3.将纯化的CHIPs蛋白分别与表达C3aR，C5aR，C5L2，CXCR3或PTAFR的HEK293T孵育，通过Western blot方法检测其结合能力。
　　 4.非特异性硫化抑制剂NaClO3干预表达C5aR的HEK293T细胞，检测不同浓度的NaClO3对C5aR与CHIPs结合能力的影响；比较了TPST或shRNA共转染的C5aR与CHIPs蛋白亲和能力的变化；将C5aR氨基末端第11位或（和）第14位的酪氨酸突变成苯丙氨酸，证实这两个位点的酪氨酸硫化修饰对C5aR与CHIPs亲和能力的重要性。
　　 结果：本实验构建了重组CHIPs和多种趋化因子受体表达载体，得到纯度较高的CHIPs蛋白样品，浓度为96μg/ml，并将C3aR，C5aR，C5L2，CXCR3和PTAFR分别表达在HEK293T细胞上。通过western blot方法测定CHIPs蛋白与C5aR相结合，与C3aR，C5L2，CXCR3和PTAFR无明显结合信号。NaClO3对C5aR与CHIPs结合能力的影响具有浓度依赖性；当NaClO3终浓度达到50mmol/L时，C5aR与CHIPs结合能力较对照组减弱76.47％；与TPST共转染的C5aR与CHIPs结合能力增强2.3倍，而与shRNA共转染的C5aR与CHIPS的结合能力未见显著减弱；当C5aR的N端第14位的酪氨酸突变成苯丙氨酸时，C5aR与CHIPs的亲和能力较野生型下降76.32％，而当C5aR的N端第11位和第14位的酪氨酸都突变成苯丙氨酸时，C5aR与CHIPs几乎不存在结合。
　　 结论：人C5aR，非C5L2，是CHIPs蛋白的天然受体。研究证实C5aR的N端第14位的酪氨酸硫化修饰对于C5aR与配基的结合具有非常重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写

第一部分 重组趋化抑制蛋白的原核表达纯化及趋化因子受体的表达鉴定

材料与方法

结果

讨论

小 结

参考文献

第二部分 CHIPs与趋化因子受体相互作用

材料与方法

结果

讨论

小 结

参考文献

第三部分 C5a受体翻译后酪氨酸硫化修饰的意义

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

论文综述

参考文献

致谢