hFXYD6蛋白在肝癌组织中的表达及hFXYD6抗体对HepG2细胞生长的影响机制

摘要

探索肝癌的肿瘤标志物及其生物治疗靶点是提高肝癌诊疗疗效的不可忽视关键因素。本课题组前期研究证实人FXYD6为胆管癌分化相关抗原，研制了兔抗人FXYD6抗体，发现FXYD6蛋白在胆管癌和胰腺癌组织有高水平的表达。为深入研究FXYD6基因蛋白在肝癌组织中的表达和FXYD6抗体对于肝癌细胞生长的影响奠定了基础。
　　 目的：
　　 1.观察研究人FXYD6基因在正常肝脏、肝硬化组织和肝癌组织中的差异性表述，检测该基因蛋白对于肝癌的病理辅助诊断价值。
　　 2.探讨抗人FXYD6抗体对HepG2肝癌细胞体外生长的影响及其机制。
　　 方法：
　　 1.采用免疫组织化学染色方法显示FXYD6蛋白在人正常肝脏(n=8)、癌旁的肝硬化组织和肝癌组织(n=40)中的表达，用组织切片自动扫描分析仪(OlympusBX-61 U—PMTVC4M2532)联合Applied Imaging软件对FXYD6蛋白的表达进行自动定量分析。
　　 2.采用葡萄糖消耗实验和MTT实验检测抗人FXYD6抗体对于人HepG2肝癌细胞体外生长的影响。采用Northern blot技术、Western blot技术探讨FXYD6抗体对于肝癌细胞影响作用机制。
　　 3.统计处理时，计量资料以均数±标准差表示，应用配对资料t检验进行统计学分析，统计学处理应用EXCELL进行均数和标准差统计，用CHISS统计分析软件进行F检验分析。P<0.05表示为有显著性统计学意义，p<0.01表示差异非常显著。
　　 结果：
　　 1.FXYD6蛋白棕黄色染色颗粒位于胞膜和胞浆，以胞浆为主。FXYD6胞浆阳性细胞率在肝癌、肝硬化组织及正常肝脏组织依次显著性的降低(p=0.000)。FXYD6蛋白的表达水平以细胞FXYD6蛋白阳性染色密度值表示，即FXYD6阳性细胞数百分率和着色胞浆密度的乘积，在肝癌组织、肝硬化组织和正常肝脏组织顺次显著性的降低(p=0.000)。
　　 2.细胞培养液内的FXYD6抗体为1：200时，葡萄糖消耗和MTT实验提示HepG2细胞的糖消耗和细胞生长均受到明显的抑制。与对照组或FXYD6反义DNA组比较，FXYD6抗体能显著的抑制HepG2细胞的增殖生长，FXYD6抗体联合应用FXYD6反义DNA对于HepG2细胞的抑制作用和FXYD6抗体的抑制作用无显著性的区别。
　　 3.和含有FXYD6抗体的培养液培养后，HepG2细胞内的Fxyd6mRNA的水平在培养后第3天明显降低；Western印迹实验中，当培养液中FXYD6抗体浓度为50μl/ml时，HepG2细胞内的表达的FXYD6蛋白明显的低于其他处理组。
　　 结论：
　　 1.首次发现FXYD6与肝癌分化相关，从正常肝脏组织、肝硬化组织到肝癌组织，FXYD6蛋白表达量依次显著性递增。
　　 2.FXYD6抗体在适当的浓度下能抑制体外培养的HepG2肝癌细胞的糖消耗量，抑制肝癌细胞的增殖和生长。但这种抑制作用无剂量一效应关系。
　　 3.抗人FXYD6抗体能抑制HepG2细胞的生长，FXYD6抗体联合FXYD6反义DNA并不能提高其抑制作用。FXYD6抗体可能在基因的转录和翻译环节方面影响体外培养的HepG2肝癌细胞的生长。
　　 4.首次应用组织切片自动扫描分析仪(Olympus BX-61)联合AppliedImaging软件对肝脏及肝癌组织中表达的FXYD6蛋白水平进行自动定量分析，该研究方法是一种客观的准确的自动定量分析方法，有推广应用价值。