黄芪总黄酮及其活性成分对肿瘤细胞的抑制作用与机理研究

摘要

一、研究背景
　　 肝癌是世界发病率最高的五大癌症之一，每年有上百万人死于肝癌，世界范围内每年的新发病例数约为550000，占人类癌症的5％，是死亡率仅次于胃癌、食管癌的第三大常见恶性肿瘤，我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。目前对肝癌的主要治疗方法是进行手术治疗（切除或抑制），但大多数肝癌病人发现时已属晚期，并不符合手术治疗条件，并且手术治疗后面临术后易复发转移的问题。
　　 白血病是严重危害人类生命健康的造血系统的恶性肿瘤，K562细胞株是一株恶化程度较高的人类慢性髓源性白血病细胞系，在体外具有分化为红细胞和多种髓细胞的多能性.迄今白血病的治疗仍主要采用传统的大剂量联合化疗，但此疗法副作用大，复发率高，而且对正常机体免疫与造血系统有极大的损害。研究恶性肿瘤尤其是白血病细胞的逆转机制已成为当今生物医学领域内最热点的前沿课题之一，从祖国医学宝库中寻找抑制白血病恶性增殖已成为治疗白血病的希望和重要途径。
　　 黄芪是一味历史悠久、临床应用十分广泛的中药，具有保护心脑血管、免疫调节、抗病毒、降低肝损伤、抗氧化、抗突变和治疗糖尿病等作用。研究还发现，该类化合物在癌症的预防和治疗方面具有较强的活性。近年来，关于黄芪提取物及其主要成分的免疫调节作用和心血管保护作用的研究已取得很大进展。黄芪总黄酮是从黄芪中分离的抗氧化清除自由基的主要活性成分，经军事医学科学院放射医学研究所鉴定，黄芪总黄酮中主要含有6种单体化合物，其中4种为异黄酮类化合物，它们分别是：β-谷甾醇、芒柄花素、毛蕊异黄酮、β-谷甾醇-3.0-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。本课题选用实体瘤的细胞株BEL-7402和血液病细胞株K562，研究黄芪总黄酮及其单体化合物对肝癌细胞、红白血病细胞生长的抑制作用并探讨了其部分相关机制。
　　 二、研究内容和目的
　　 1.体外观察黄芪总黄酮及其单体化合物抑制肝癌细胞株BEL-7402、红白血病细胞株K562生长的作用，明确量效关系，选择药物的半数抑制浓度为后期机制研究作参考。
　　 2.明确黄芪总黄酮及其单体化合物对BEL-7402细胞周期的影响，进一步研究药物对细胞周期相关基因的改变情况；同时研究黄芪总黄酮及其单体化合物对BEL-7402细胞蛋白组的影响。
　　 3.明确黄芪总黄酮及其单体化合物对K562细胞凋亡诱导的影响，并确定药物对K562细胞内cyclin D1 mRNA的影响。
　　 4.为临床应用黄芪治疗肝癌、红白血病提供科学的实验依据。
　　 三、研究方法
　　 1.应用MTT法测定不同浓度（20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml）的黄芪总黄酮及其单体化合物作用不同时间（24h、48h、72h）对红白血病细胞株K562的生长抑制作用；中性红方法测定不同浓度（1μg/ml、3.16μg/ml、10μg/ml、31.6μg/ml、100μg/ml和316μg/ml）的黄芪总黄酮及其单体化合物对人肝癌细胞株BEL-7402的生长抑制作用。
　　 2.流式细胞仪（FCM）采用PI染色检测不同浓度的黄芪总黄酮及其单体化合物对肝癌细胞株BEL-7402、红白血病细胞株K562细胞周期分布的影响。
　　 3.采用Annexin V/PI凋亡试剂盒通过FCM分析检测黄芪总黄酮及其单体化合物诱导K562细胞凋亡的情况，选择半数抑制浓度作用不同时间（2h、4h、6h、12h和24h），观察是否具有浓度以及时间依赖性。
　　 4.基于对细胞周期阻滞的确定性判断，采用基因芯片方法检测黄芪总黄酮及其单体化合物对BEL-7402细胞周期相关基因的改变。
　　 5.应用双向凝胶电泳、MALDI-TOF-MS生物质谱技术研究黄芪总黄酮及其单体化合物对BEL-7402细胞蛋白组的影响。
　　 6.RT-PCR技术检测黄芪总黄酮及其单体化合物毛蕊异黄酮对K562细胞内cyclin D1 mRNA水平的影响。
　　 四、研究结果
　　 1.0TT结果显示，黄芪总黄酮及毛蕊异黄酮对K562细胞的生长抑制作用呈时间依赖性和剂量依赖性，其24h、48h和72h的半数抑制浓度（IC50）分别为98.63μg/ml、87.90μg/ml、63.10μg/ml和130.32μg/ml、123.03μg/ml、122.18μg/ml；中性红结果显示，黄芪总黄酮、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对BEL-7402细胞作用48h后的IC50分别为40μg/ml、69.93μg/ml、100μg/ml、100μg/ml和100μg/ml。
　　 2.黄芪总黄酮及其单体化合物作用于K562、BEL-7402细胞，在一定浓度范围内随浓度增加，G0/G1期比例明显增加，S期细胞明显减少；用半数抑制浓度剂量的黄芪总黄酮及毛蕊异黄酮并不能明显诱导K562细胞的凋亡。
　　 3.细胞周期基因芯片检测显示黄芪总黄酮及其活性成分作用BEL-7402细胞48h后，与对照组比较，黄芪总黄酮、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷组差异表达基因分别为45、17、6、4和25条。
　　 4.蛋白质组技术显示与对照组相比，黄芪总黄酮组表达上调的蛋白有11种，表达下调的蛋白有1种，质谱鉴定出10个差异蛋白；毛蕊异黄酮作用于BEL-7402细胞，表达上调的蛋白有14种，表达下调的蛋白有2种，质谱鉴定出14个差异蛋白；毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作用于BEL-7402细胞，表达上调的蛋白有6种，表达下调的蛋白有7种，质谱鉴定出10个差异蛋白；芒柄花素作用于BEL-7402细胞，表达上调的蛋白有8种，表达下调的蛋白有4种，质谱鉴定出9个差异蛋白；芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作用于BEL-7402细胞，表达上调的蛋白有10种，表达下调的蛋白有5种，质谱鉴定出12个差异蛋白。
　　 5.RT-PCR技术检测显示IC50剂量的黄芪总黄酮及毛蕊异黄酮对K562细胞作用24h后，cyclin D1 mRNA水平开始下降。
　　 五、研究结论
　　 1.黄芪总黄酮及其单体化合物能够抑制K562细胞、BEL-7402细胞的生长，且抑制作用呈时间依赖性和剂量依赖性。
　　 2.黄芪总黄酮能够阻滞BEL-7402细胞周期在G0/G1期，可能与上调CDKN3、CDKN1B、CDKN2B、CDKN2C和RB1，下调CDK5、Skp2、E2F1，CCNF和CCND3的表达相关；毛蕊异黄酮能够阻滞BEL-7402细胞周期在G0/G1期，可能与上调RBX1、CDC2，下调CKS1、CCNA2、Skp2、E2F2、CCND3、CCNC的表达相关；毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷将BEL-7402细胞周期组滞在G0/G1期，可能与下调CCNA2、CDK2、CCNB1有关；芒柄花素能够将细胞阻滞在GdG1期，可能与上调GADD45A、CKS2、Skp1A有关；芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷能够将细胞阻滞在G0/G1期，可能与上调CDC2、GADD45A、CKS2、CDKN1B、Skp1A、RBX1，下调Skp2、CCNF、CCND3有关。
　　 3.蛋白质组学鉴定技术显示黄芪总黄酮能改变BEL.7402细胞中10种蛋白质的表达，毛蕊异黄酮能改变BEL.7402细胞中14种蛋白质的表达，毛蕊异黄酮-7-O-β-D一吡喃葡萄糖苷能改变BEL.7402细胞中10种蛋白质的表达，芒柄花素能改变BEL.7402细胞中9种蛋白质的表达，芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷能改变BEL-7402细胞中12种蛋白质的表达，其中与肿瘤发生的相关蛋白有转胶蛋白2、磷酸化应激诱导蛋白1、抗氧化蛋白1、内质网蛋白29、磷酸甘油酸变位酶1、胆绿素还原酶B、硫氧还原蛋白过氧化物酶等，这些蛋白表达的改变可能与黄芪总黄酮及其单体化合物的抗肿瘤机制有关。
　　 4.黄芪总黄酮及毛蕊异黄酮能够下调K562细胞内cyclin D1的mRNA水平，阻止细胞周期蛋白复合物的磷酸化，阻止细胞周期中调控点G1/S的转变，从而抑制K562细胞的增殖。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

前 言

第一部分 黄芪总黄酮及其活性成分对不同肿瘤细胞增殖的影响

1.材料

2.方法

2.1 细胞培养

2.2 细胞毒性测定MTT比色法

2.3 中性红测定比色法

3.结果

3.1 黄芪总黄酮体外抗肿瘤细胞的实验结果

3.2 黄芪总黄酮及毛蕊总黄酮对K562细胞增殖的抑制作用

3.3 黄芪总黄酮及其活性成分对BEL-7402细胞增殖的抑制作用

4.讨论

第二部分 黄芪总黄酮及其活性成分对肿瘤细胞抑制作用的机理研究

1.材料

2.实验方法

2.1 细胞培养

2.2 流式细胞仪检测黄芪总黄酮及其活性成分对肿瘤细胞凋亡的影响

2.3 流式细胞仪检测黄芪总黄酮及其活性成分对肿瘤细胞周期的作用

2.4 基因芯片技术检测黄芪总黄酮及其活性成分对肿瘤细胞周期相关基因的影响

3.结果

3.1 黄芪总黄酮及毛蕊异黄酮对K562细胞凋亡的影响

3.2 黄芪总黄酮及其活性成分对K562和BEL-7402细胞周期的作用

3.3 黄芪总黄酮及其活性成分对BEL-7402细胞周期相关基因的影响

3.4 黄芪总黄酮及其活性成分对BEL-7402细胞的蛋白质的影响

3.5 黄芪总黄酮及毛蕊异黄酮对K562细胞的cyclin D1 mRNA的作用

4.讨论

结论

参考文献

文献综述

参考文献

攻读学位期间发表的文章

致谢