白念珠菌磷酶酶B的原核表达、纯化及功能验证

摘要

背景：白念珠菌是一种重要的人类致病真菌,可引起机体浅部和深部的广泛损害,毒力因子包括黏附素、利于侵入的酶、形态发生及表型转换、受体等几个方面。其中磷脂酶B是白念珠菌重要的毒力因子,与白念珠菌致病有直接关系即在白念珠菌入侵宿主的早期发挥作用,包括对上皮细胞的黏附、入侵和损伤。磷脂酶B与白念珠菌感染密切相关,其在感染过程中的作用逐渐受到重视,并逐渐成为研究热点。
　　 目的：构建磷脂酶B1和B2的重组表达体,在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物并进行生物活性检测,为探索磷脂酶B1和B2重组蛋白的致病和耐药机制奠定基础,也为研制新型抗真菌药物、诊断试剂及抗真菌疫苗等提供理论基础及科学依据。
　　 方法：从白念珠菌中提取基因组DNA为模板,用PCR方法获取磷脂酶B1和B2基因。将原核表达载体pEGX-4T-1分别与磷脂酶B1和B2基因行双酶切,琼脂糖凝胶纯化,连接酶切产物,转化大肠杆菌TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。将重组原核表达载体pEGX-4T-1/PLB1和pEGX-4T-1/PLB2转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在37℃经IPTG诱导表达出包涵体融合蛋白。包涵体蛋白尿素中变性复性后经亲和层析、阴离子交换层析和反相高效液相层析纯化,并用凝血酶酶切标签,得到纯化的磷脂酶B1和B2蛋白,并通过凝胶扩散法检测其生物学活性。
　　 结果：经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同,并定向插入原核表达载体pEGX-4T-1中,双酶切后电泳获得预期的磷脂酶B1和B2基因条带,测序证实为正确序列。重组原核表达载体pEGX-4T-1/PLB1和pEGX-4T-1/PLB2的基因工程菌在37℃经IPTG诱导后均表达出包涵体融合蛋白,其在尿素中变性复性后经纯化、酶切后得到目的蛋白,并验证其具有生物学活性。
　　 结论：⑴成功构建了pEGX-4T-1/PLB1和pEGX-4T-1/PLB2原核表达载体,将其转化至大肠杆菌后表达出磷脂酶B1和B2的重组蛋白；⑵重组蛋白变性、复性后经亲和层析等纯化及凝血酶酶切后得到了目的蛋白；⑶重组蛋白磷脂酶B1和B2具有良好的生物学活性。