耐盐嗜碱芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的原核表达纯化及功能研究

摘要

β-葡萄糖苷酶是一种能够水解碳水化合物糖苷键的水解酶。它的水解特性决定其广阔的应用前景。β-葡萄糖苷酶的应用非常广,在水解纤维素、生产低聚龙胆糖、作为风味酶、肿瘤诊断和治疗方面都具有巨大的应用潜力。长期以来,由于酶的活力不高、酶的产量低及酶的比活力低等因素一直影响该酶的实际应用。虽然β-葡萄糖苷酶在微生物中广泛存在,但是产酶效率不高,难以获得大量的产品。最近,来自于极端微生物体内的β-葡萄糖苷酶成为研究的热点,主要是因为这些酶可能具有潜在的特殊生物功能。通过基因重组技术构建工程菌,分泌表达高活性的β-葡萄糖苷酶对研究其应用具有重要的意义。
　　 本文选择了耐盐嗜碱芽孢杆菌C-125(Bacillus halodurans C-125)做为研究对象。根据网上公布的β-葡萄糖苷酶的序列设计引物,使用PTDS法化学合成该菌的β-葡萄糖苷酶的编码基因Bhbgl,然后根据大肠杆菌的密码子偏爱性,对该基因进行改造。然后将该基因构入到原核表达载体并导入到大肠杆菌DH5α中,构建出高效表达该基因的生物工程菌株。并首次对重组的极端嗜碱菌β-葡萄糖苷酶进行分离纯化和有关酶学性质的研究。
　　 以oNPGlu为底物,通过底物浓度、反应温度、反应时间、反应pH的考察,确定了该酶的最佳测定条件,并对该酶的pH稳定性、热稳定性、米氏常数、金属离子及碳水化合物对其影响等进行了研究。研究结果表明:该重组酶最适pH为7.0,最适温度为50℃,热稳定性在30-50℃之间,同时具有很高的pH稳定性。对底物oNPGlu的米氏常数Km为0.32 mM,最大反应速度Vmax为120 U/mg;Zn2+,Fe3+和Cd2+对酶有强的抑制作用;葡萄糖,半乳糖,木糖和蔗糖都能提高酶的活性。