一种来自极端嗜碱菌的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表达和纯化

摘要

本发明涉及一种来自极端嗜碱菌的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表达和纯化。所述的β-葡萄糖苷酶的基因，是通过化学合成得到，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，全长1374bp，其编码的核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。将该基因构入到原核表达载体中并转化入原核生物中，可用于β-葡萄糖苷酶的工业生产应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种来自极端嗜碱菌的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表达和纯化，具体 涉及一种来自极端嗜碱菌Bacillus halodurans C-125的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表达 和纯化。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)是一种能够水解碳水化合物之间糖苷键的水解酶(J Struct  Biol 129：69-79)。酶学分类系统根据其氨基酸序列将β-葡萄糖苷酶分为两类：糖苷水解酶 家族1(GHFl)和糖苷水解酶家族3(GHF3)。β-葡萄糖苷酶的应用范围很广，我们研 究它的应用主要集中在它降解纤维素，木聚糖(Appl Environ Microbiol 68：1485-1490)以 及植物产生的各种化合物(Mol Plant Microbe Interact 13：1041-1052)的功能。除此之外， 还有它参与植物与病原菌之间的相互作用和其生物应用。众所周知，β-葡萄糖苷酶给工 业生产方面带来了巨大的贡献。大量的β-葡萄糖苷酶的基因从动物(Enz Microbial Technol 43：35-42)、植物(Bioresou Technol 99：6081-6087)和微生物(J Microbiol 47：542-548) 中分离出来，进行了系统的研究。最近，来自于极端微生物体内的β-葡萄糖苷酶成为研 究的热点，主要是因为这些酶可能具有潜在的特殊生物功能。

在NCBI数据库中，收集了很多微生物的全基因组信息，其中编码蛋白的序列都被注 释了。但是大部分的蛋白的生化功能和生理功能都是未知的。因此研究注释蛋白的功能 可以完善这些酶学，并运用到工业应用中去。

极端嗜碱菌Bacillus halodurans C-125是1977年首次被日本科学家分离出来的，并在 2000年完成了基因组的测序(Nucleic Acids Res 28：4317-4331)。在过去的二十多年里， 很多来自该碱性微生物中酶被分离出来并商业化了，其中含有半乳糖苷酶(Agri and Bio  Chem 43：85-88)，木聚糖酶(J Bacteriol 161：784-785)，木糖酶(Appl Microbiol Biotechnol 73：582-590)和乙酰酯酶(J Bacteriol 190：1375-1382)等。然而来自该菌的β-葡萄糖苷酶 还从未研究过，也未见对该酶生理生化研究的报告。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种来自极端嗜碱菌的β-葡萄糖苷酶基 因，所述的极端嗜碱菌为Bacillus halodurans C-125。

本发明所要解决的技术问题之二，在于提供一种所述β-葡萄糖苷酶基因的化学合成 方法。

本发明所要解决的技术问题之三，在于提供一种所述β-葡萄糖苷酶基因在原核生物 中的表达及其应用。

本发明的技术方案是通过以下方式来实现的。

本发明所述的β-葡萄糖苷酶基因，来自于极端嗜碱菌Bacillus halodurans C-125，其 核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。

所述的β-葡萄糖苷酶基因是通过化学合成方法制备而成的。该方法采用大量重叠的 引物通过两步PCR进行全基因的合成(PTDS)(Nucleic Acids Research，2004，32：e98)。 即首先通过重叠延伸获得合成基因的片段，再通过最外侧的引物将全长的基因扩增得到 目的基因。该方法一个明显的优势就是不需要对引物进行磷酸化处理。而且通过高通量 的DNA合成仪器，可以较为便利地获得大量的引物。

所述的β-葡萄糖苷酶基因的合成方法，包括以下步骤：

1、引物设计

设计长度大概为60mer左右的覆盖整个β-葡萄糖苷酶基因的寡核苷酸的引物序列34 个，且每相邻的两个寡核苷酸引物序列有20个碱基的重复。

利用PCR进行β-葡萄糖苷酶扩增，在100μl反应体系中，P2-P33共32个引物的添加 量为2ng，外侧引物P1和P34添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃， 30s，72℃，10min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25 个循环。

PCR结束后，1％琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生 物公司)。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。获得长度为1374bp的SEQ ID No 1序 列的阳性克隆，即为本发明的β-葡萄糖苷酶基因。

将上述SEQ ID No 1序列直接与原核表达载体pYM4087相连，4℃连接2小时。然 后将该载体转化感受态大肠杆菌TOP10(Invitrogen)。将菌液涂布于含有50μg/mL氨苄 青霉素的固体LB培养基(15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨， 磷酸缓冲液pH7.5)培养后获得淡蓝色菌落。

本发明的有益效果

本发明通过克隆，高效合成出β-葡萄糖苷酶，它是一类应用非常广的生物用酶。通 过对该基因的原核表达和纯化，可以应用于β-葡萄糖苷酶的工业化生产中。

附图说明

图1为本发明的β-葡萄糖苷酶基因的化学合成策略图。

图2为以pYM4087质粒构建DNA表达单元示意图。

图3为酶的最适温度及温度的稳定性，其中A为最适温度，B为温度的稳定性。

图4为酶的最适pH及pH的稳定性。

图5为金属离子对酶活的影响。

图6为葡萄糖、木糖、蔗糖和半乳糖对酶活的影响。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而 非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和 范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆 布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。)

实施例1β-葡萄糖苷酶基因的化学合成

参看图1，以基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)来克隆合成本发明 的β-葡萄糖苷酶基因。设计的引物分别如下：

P1：Tm＝54，60mer

GGA，TCC，ATG，TCT，ATC，ATT，CAG，TTT，CCA，AAG，GAG，ATG，AAG，TGG，GGT，GTT，GCT，ACT，GCT，TCT

P2：Tm＝54，60mer

CAC，CTC，TAC，CAC，CAG，CAT，TGA，TAG，CAC，CTT，CGA，TCT，GGT，AAG，AAG，CAG，TAG，CAA，CAC，CCC

P3：Tm＝54，60mer

CAA，TGC，TGG，TGG，TAG，AGG，TGC，TTC，CAT，CTG，GGA，TGT，CTT，TGC，CAA，GAC，TCC，AGG，TAA，GGT

P4：Tm＝54，60mer

ATA，GGA，GTC，ACA，GGC，AAC，ATC，ACC，ATT，GTC，ACC，GTT，CTT，GAC，CTT，ACC，TGG，AGT，CTT，GGC

P5：Tm＝54，60mer

ATG，TTG，CCT，GTG，ACT，CCT，ATC，ACA，GAT，ACG，AAG，AAG，ACA，TTG，AGA，TCA，TGA，AGG，ATC，TTG

P6：Tm＝54，60mer

ATT，CTT，GGC，CAA，GCA，ACA，GAG，AAT，CTG，TAC，ATG，TCA，ACA，CCA，AGA，TCC，TTC，ATG，ATC，TCA

P7：Tm＝54，60mer

TCT，GTT，GCT，TGG，CCA，AGA，ATC，TTT，CCA，AAC，GGT，ACT，GGT，GAA，GTC，TCC，AGA，GAA，GGT，CTT

P8：Tm＝54，60mer

CAT，TCT，CGG，TGA，GTC，TGT，CAA，CGA，GTC，TGT，GAT，AGT，AAT，CAA，GAC，CTT，CTC，TGG，AGA，CTT

P9：Tm＝54，60mer

TGA，CAG，ACT，CAC，CGA，GAA，TGG，TAT，TCA，ACC，AAT，GTG，TAC，TCT，CTA，CCA，TTG，GGA，TCT，GCC

P10：Tm＝54，60mer

GTC，TCT，GTT，GTC，CCA，ACC，ACC，TTT，CTC，TTG，CAG，AGC，TTG，TGG，CAG，ATC，CCA，ATG，GTA，GAG

P11：Tm＝54，60mer

GTG，GTT，GGG，ACA，ACA，GAG，ACA，CCA，TCG，ATG，CCT，TTG，TCA，GAT，ACG，CTG，AAG，TCA，TGT，TCA

P12：Tm＝54，60mer

TTG，AAG，GTG，ATC，CAG，TGG，TTG，ATC，TTG，TCA，CCA，AAC，TCC，TTG，AAC，ATG，ACT，TCA，GCG，TAT

P13：Tm＝54，60mer

AAC，CAC，TGG，ATC，ACC，TTC，AAC，GAA，CTG，TGG，TGT，GTT，TCC，TTC，CTC，TCC，AAC，TAC，ATT，GGT

P14：Tm＝54，60mer

TGG，TAG，CAA，GCT，GGA，GAT，CGG，TAT，TGC，CTG，GAG，CAT，GGA，CAC，CAA，TGT，AGT，TGG，AGA，GGA

P15：Tm＝54，60mer

CGA，TCT，CCA，GCT，TGC，TAC，CAA，CGT，TGC，TCA，CCA，TCT，TCT，TGT，TGC，TCA，TGG，TAA，GGC，TGT

P16：Tm＝54，60mer

ACC，AAT，CTG，ACC，ATC，AAG，ACC，CAT，CTT，TCT，GTA，GGA，CTG，AAC，AGC，CTT，ACC，ATG，AGC，AAC

P17：Tm＝54，60mer

GTC，TTG，ATG，GTC，AGA，TTG，GTT，ATG，CTC，CTA，ACG，TCG，AGT，GGA，ACG，AAC，CAT，TCT，CCA，ATC

P18：Tm＝54，60mer

CAG，CCA，TTG，CCT，CTC，TTA，CAG，GCT，TCA，GCA，TCT，TCC，ATC，TGA，TTG，GAG，AAT，GGT，TCG，TTC

P19：Tm＝54，60mer

TGT，AAG，AGA，GGC，AAT，GGC，TGG，TTC，ATC，GAG，TGG，TTC，ATG，GAC，CCA，GTC，TTC，AAA，GGT，GCC

P20：Tm＝54，60mer

TGC，CTT，TCT，TCT，CGA，ACC，ATT，CGA，CCA，AGA，AGG，ATG，GGT，AGG，CAC，CTT，TGA，AGA，CTG，GGT

P21：Tm＝54，60mer

ATG，GTT，CGA，GAA，GAA，AGG，CAT，CAC，TGT，TCC，AAT，TGA，AGC，TGG，TGA，TAT，GGA，GAC，CAT，CCA

P22：Tm＝54，60mer

ACC，AGT，GTA，GTA，GTT，GAT，GCC，AAG，GAA，GTC，GAT，TGG，TTG，TTG，GAT，GGT，CTC，CAT，ATC，ACC

P23：Tm＝54，60mer

GCA，TCA，ACT，ACT，ACA，CTG，GTT，CTG，TTG，CCA，GAT，ACA，AGG，AGA，ACG，AAG，GTC，TCT，TTG，ACC

P24：Tm＝54，60mer

CCA，ATG，TCA，GTC，TTC，TCA，TAG，CCA，GCA，TCG，ACT，TTC，TCC，AGG，TCA，AAG，AGA，CCT，TCG，TTC

P25：Tm＝54，60mer

TAT，GAG，AAG，ACT，GAC，ATT，GGC，TGG，AAC，ATC，TAT，CCA，GAA，GGC，TTC，TAC，AAG，GTC，CTG，TAC

P26：Tm＝54，60mer

TGA，TGT，AGA，TTG，GAA，TCT，GAC，CAT，ACT，GTT，CAG，TGA，TGT，AGT，ACA，GGA，CCT，TGT，AGA，AGC

P27：Tm＝54，60mer

TCA，GAT，TCC，AAT，CTA，CAT，CAC，TGA，GAA，TGG，TTC，CTG，CTA，CAA，CGA，CGA，ACC，AGT，CAA，TGG

P28：Tm＝54，60mer

CTG，AGA，CAG，GTA，TCT，GAT，TCT，ACC，TTC，ATC，CTT，GAC，TTG，ACC，ATT，GAC，TGG，TTC，GTC，GTT

P29：Tm＝54，60mer

GAA，TCA，GAT，ACC，TGT，CTC，AGC，ACC，TGA，CTG，CTC，TCA，AGA，GAA，GCA，TGG，AGT，CTG，GTG，TCA

P30：Tm＝54，60mer

AAG，TTG，TCG，AGC，AGG，GAC，CAA，GCC，ATG，TAG，CCT，TTG，ATG，TTG，ACA，CCA，GAC，TCC，ATG，CTT

P31：Tm＝54，60mer

TGG，TCC，CTG，CTC，GAC，AAC，TTT，GAA，TGG，GCT，GAA，GGC，TAC，TCT，ATG，AGA，TTC，GGT，ATC，GTT

P32：Tm＝54，60mer

AGT，CCT，TCT，TGG，TTC，TCT，CAA，GGG，TTC，TGT，AGT，TGA，CGT，GAA，CGA，TAC，CGA，ATC，TCA，TAG

P33：Tm＝54，60mer

TGA，GAG，AAC，CAA，GAA，GGA，CTC，TTT，CTA，CTG，GTA，CAA，ACA，GAT，GAT，TGC，CAA，CCA，GTT，CTT

P34：Tm＝54，54mer

GAG，CTC，TTA，ATG，GTG，ATG，GTG，ATG，GTG，GAG，TTC，GAA，GAA，CTG，GTT，GGC，AAT，CAT

利用PCR进行β-葡萄糖苷酶基因的扩增，在100μl反应体系中，P2-P33共32个引物 的添加量为2ng，外侧引物P1和P34添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30 s，50℃，30s，72℃，10min，使用的TaqDNA聚合酶为KOD FXtaq酶(Toyobo公司，日本)， 共25个循环。

PCR结束后，1％琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。 4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。获得阳性克隆，即为本发明的β-葡萄糖苷酶基因， 其序列如SEQ ID No 1所示。将该SEQ ID No 1序列与来自极端嗜碱菌Bacillus halodurans C-125的β-葡萄糖苷酶基因相比对，同源性为79％，具体如下：

1   GTGGATATGTATCGCTTCTCTGTTGCTTGGCCGCGAATTTTTCCGAATGGTACAGGGGAG

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223 GTTGACATGTACAGATTCTCTGTTGCTTGGCCAAGAATCTTTCCAAACGGTACTGGTGAA

61  GTGTCACGTGAAGGATTAGATTATTACCATCGACTTGTTGATCGTTTAACCGAAAACGGG

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283 GTCTCCAGAGAAGGTCTTGATTACTATCACAGACTCGTTGACAGACTCACCGAGAATGGT

121 ATTCAACCGATGTGTACTCTCTACCATTGGGATTTGCCGCAAGCATTGCAAGAAAAGGGC

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343 ATTCAACCAATGTGTACTCTCTACCATTGGGATCTGCCACAAGCTCTGCAAGAGAAAGGT

181 GGCTGGGATAATCGCGACACGATCGACGCTTTTGTCCGTTATGCTGAGGTCATGTTCAAA

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403 GGTTGGGACAACAGAGACACCATCGATGCCTTTGTCAGATACGCTGAAGTCATGTTCAAG

241 GAGTTCGGTGATAAAATTAACCACTGGATTACTTTTAATGAGCTGTGGTGCGTTTCTTTC

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463 GAGTTTGGTGACAAGATCAACCACTGGATCACCTTCAACGAACTGTGGTGTGTTTCCTTC

301  CTTTCAAATTATATCGGTGTCCATGCACCTGGAAATACCGATCTCCAGCTAGCGACAAAT

     || || || || || ||||||||||| || || ||||||||||||||||| || || ||

523  CTCTCCAACTACATTGGTGTCCATGCTCCAGGCAATACCGATCTCCAGCTTGCTACCAAC

361  GTGGCCCACCATCTTCTAGTTGCTCATGGAAAAGCGGTTCAGTCGTATCGAAAAATGGGG

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583  GTTGCTCACCATCTTCTTGTTGCTCATGGTAAGGCTGTTCAGTCCTACAGAAAGATGGGT

421  CTTGATGGACAAATCGGGTACGCGCCGAATGTAGAATGGAATGAGCCTTTCAGCAATCAA

     |||||||| || || || || || || || || || ||||| || || |||  ||||||

643  CTTGATGGTCAGATTGGTTATGCTCCTAACGTCGAGTGGAACGAACCATTCTCCAATCAG

481  ATGGAGGATGCTGAAGCTTGTAAGCGGGGGAATGGTTGGTTTATCGAATGGTTTATGGAT

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703  ATGGAAGATGCTGAAGCCTGTAAGAGAGGCAATGGCTGGTTCATCGAGTGGTTCATGGAC

541  CCAGTCTTCAAGGGAGCCTACCCATCTTTCTTAGTCGAATGGTTTGAGAAGAAAGGGATT

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763  CCAGTCTTCAAAGGTGCCTACCCATCCTTCTTGGTCGAATGGTTCGAGAAGAAAGGCATC

601  ACCGTACCGATTGAGGCTGGAGATATGGAGACAATCCAACAACCAATCGACTTTTTAGGA

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823  ACTGTTCCAATTGAAGCTGGTGATATGGAGACCATCCAACAACCAATCGACTTCCTTGGC

661  ATTAACTATTATACGGGAAGTGTTGCCCGCTACAAGGAGAACGAAGGACTATTTGATCTA

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883  ATCAACTACTACACTGGTTCTGTTGCCAGATACAAGGAGAACGAAGGTCTCTTTGACCTG

721  GAAAAAGTAGATGCAGGTTATGAGAAAACGGATATTGGCTGGAACATTTATCCTGAAGGC

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943  GAGAAAGTCGATGCTGGCTATGAGAAGACTGACATTGGCTGGAACATCTATCCAGAAGGC

781  TTTTACAAAGTGTTGTACTATATAACTGAGCAATATGGACAAATCCCGATTTATATTACG

     || ||||| ||  ||||||| || ||||| || ||||| || || || || || || ||

1003 TTCTACAAGGTCCTGTACTACATCACTGAACAGTATGGTCAGATTCCAATCTACATCACT

841  GAAAATGGGTCTTGTTACAATGATGAACCTGTGAATGGGCAAGTGAAGGATGAGGGGCGA

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1063 GAGAATGGTTCCTGCTACAACGACGAACCAGTCAATGGTCAAGTCAAGGATGAAGGTAGA

901  ATCCGCTACTTGAGCCAGCATTTGACGGCACTAAAGCGTAGCATGGAGTCAGGTGTCAAC

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1123 ATCAGATACCTGTCTCAGCACCTGACTGCTCTCAAGAGAAGCATGGAGTCTGGTGTCAAC

961  ATTAAAGGATACATGGCGTGGTCATTGCTCGATAATTTTGAATGGGCCGAGGGCTACAGT

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1183 ATCAAAGGCTACATGGCTTGGTCCCTGCTCGACAACTTTGAATGGGCTGAAGGCTACTCT

1021 ATGAGGTTTGGCATCGTTCACGTCAATTATCGAACGTTGGAACGGACGAAGAAGGATAGT

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1243 ATGAGATTCGGTATCGTTCACGTCAACTACAGAACCCTTGAGAGAACCAAGAAGGACTCT

1081 TTCTATTGGTATAAACAAATGATTGCCAATCAGTTCTTTGAACTTTAA

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1303 TTCTACTGGTACAAACAGATGATTGCCAACCAGTTCTTCGAACTCCACCATCACCATCAC

实施例2β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中表达

参看图2，将上述SEQ ID No 1序列直接与原核表达载体pYM4087相连，4℃连接2小 时。然后将该载体转化感受态大肠杆菌TOP10(Invitrogen)。将菌液涂布于含有50μg/mL氨 苄青霉素的固体LB培养基(15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨， 磷酸缓冲液pH7.5)，37℃培养16小时，直到有淡蓝色的菌落长出。挑取3-5个菌落，接种于 50ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5) 中，37℃摇床直到菌液的浓度达到OD600为1.0时停止培养。

实施例3β-葡萄糖苷酶基因的纯化

将实施例2最终获得的培养液在5,000g重力加速度下离心5min，无菌水清洗1次。所 得的细胞沉淀用1mL磷酸裂解缓冲液重悬，然后将其转移到微量离心管中。使用超声波仪裂 解菌液30min，以12,000g离心30min。使用微孔滤膜过滤离心好的上清，上到Ni-Agarose 柱上，纯化出目的蛋白。将目的蛋白透析后使用蛋白保存液保存起来。

实施例4β-葡萄糖苷酶基因的酶动力学特性分析

β-葡萄糖苷酶的酶动力学特性分析主要有三个底物。它们分别是：oNPGlu，oNPGal 和pNPGal。反应采用实施例3中的体系。主要测定酶对不同底物的K_m和最大反应速度 V_max。也就是在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大 的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度的增加而迅速增加；随着 底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应 速度达到一个极限值(V_max)。

底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示：

$v=\frac{V_{\max }\left[S\right]}{K_m+\left[S\right]}$

式中：v--反应速度；K_m--米氏常数；V_max--酶反应最大速度；[S]--底物浓度。

采用Linewaver-Burk作图法测定K_m、V_max，该法是根据米氏方程的倒数形式，以 1/v对1/[S]作图，得到一条直线。直线在横轴上的截距为-1/K_m，纵截距为1/V_max，求 出K_m与V_max。

$\frac{1}{v}=\frac{K_m}{V_{\max }}·\frac{1}{\left[S\right]}+\frac{1}{V_{\max }}$

在这里我们所用的三个底物的浓度是：oNPGlu(从0.1mM到2mM)，oNPGal(从 0.8mM到2.8mM)和pNPGal(从0.4mM到2.4mM)。所得到的结果如表1所示。

表1

实施例5β-葡萄糖苷酶基因的生理生化特性分析

对实施例3中保存的蛋白酶液做特定的生理生化特性分析。本分析过程是在下述的酶反 应体系中进行的：195μl Zm缓冲液(100mM磷酸钾缓冲液，10mM KCl，1mM MgSO₄，pH 7.0)中含有2mM的反应底物oNPGlu。反应以加入5μl的酶液开始，反应是在50℃的水浴 锅中进行10min，以加入60μl的1M Na₂CO₃终止反应。然后在420nm出测量对硝基苯酚的 释放量。在这里我们定义一定数量的酶在每分钟催化1μM的对硝基苯酚的活力为1U.β-葡萄 糖苷酶的蛋白浓度是使用Bradford试剂盒来分析的。

我们分析的生理生化特性主要有酶的最适温度，酶的温度的稳定性，酶的最适pH，pH 的稳定性，底物的特异性，金属离子对酶活的影响，有机溶剂对酶活的影响以及不同的糖对 酶活的影响。

在研究酶的最适反应的温度时，反应的温度从15℃开始，每隔5℃，一直到60℃。每 个体系做3个重复试验(以下每个反应都是3次重复)；在研究酶的温度的稳定性时，主要 测定酶在30，40，50和60℃这四个不同温度处理酶液，然后在最适温度下测定酶的残余活 性；在研究酶的最适反应的pH时，选择不同的缓冲液，主要有柠檬酸-磷酸钠缓冲液(0.1M， pH 3.0-5.5)，Zm缓冲液(0.1M，pH 6.0-8.0)，甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2M，pH 8.5-10.6)； 在研究酶的pH的稳定性时，是先将酶在不同的pH的缓冲液中先处理24h，然后在酶的最适 pH的测定酶的残余活性；在底物的特异性，金属离子对酶活的影响，有机溶剂对酶活的影响 以及不同的糖对酶活的影响是将酶用不同的影响因素处理，然后在酶的最佳反应体系中测定 酶的残余活性。

经实验验证，酶在50℃，pH 7时活性最高，虽然酶的热稳定性不高，在30℃处理30min 后，酶的活性只有80％了。但是酶有个很好的pH稳定性，在碱性条件处理后，依然有很高 的活性(参看图3、4)。金属离子在低浓度时对酶的影响不大，当金属离子浓度增高到5mM 时，Cd²⁺，Zn²⁺和Fe³⁺能分别抑制87％，88％和92％的活性。此外，经本试验研究发现，该 酶的活性能被葡萄糖、木糖、蔗糖和半乳糖等四种糖激活，而且在糖的浓度达到1M时，仍 然能提高酶的活性(参看图5、6)。