隐性遗传性耳聋外显子测序技术基因鉴定及基因型与表型关联研究

摘要

遗传性耳聋严重影响人类学习交流和社会活动，是亟待解决的日益严重的健康问题。预防耳聋出生缺陷，提高人口素质是关系国计民生的重大问题，而预防的根本，就是深入了解遗传基因及其突变谱，发现中国人群的耳聋基因分布和热点突变，从而能够在人们的婚育指导上进行预测，提早进行预防。目前中国大部分聋人表现为隐性遗传性耳聋，而其中60-70％尚无法明确致聋基因。本研究利用了当前蓬勃发展的新一代测序技术，针对非综合征遗传性耳聋的隐性遗传小家系进行了病因研究，发现了在国际上发病率居2-3位的CDH23基因为负责基因，并发现了新突变。同时，在当前很多耳聋基因得到鉴定的背景下，本研究针对常见隐性遗传性耳聋基因GJB2和SLC26A4，对致聋基因型与临床表型进行了关联分析，在一定程度上阐释了基因型对表型的影响及对临床诊疗的指导意义。
　　第一部分利用外显子测序技术发现隐性遗传性耳聋致聋基因CDH23
　　一、外显子测序技术在3个隐性遗传性耳聋家系中的应用
　　本研究选择了3个隐性遗传性耳聋的核心家系，家系中仅第三代有两例耳聋患者。首先进行了常见隐性耳聋基因和突变的筛查（GJB2、SLC26A4和线粒体DNA1555A>G），未发现携带突变。然后，在784和845家系中，分别选择了两个患者和父母，在855家系中，因父亲亡故，选了两个患者和同胞弟弟，叔叔，及母亲，进行了全外显子测序。
　　测序结果的质控报告显示，测序深度达到50X，外显子长度达到3千万碱基左右，达到了人类全部外显子99%以上覆盖率。每个样本经过筛选，高可信度的数据如下：95000个左右的单核苷酸变异（SNP），2500个左右的剪接位点突变（splicesite）,7000左右的插入缺失突变（indel），58000左右的在外显子临近10bp以内的内含子突变（intron）。
　　根据目前已经公开的数据库进行了SNPs过库筛选分析，所采用的数据库包括dbSNP数据库、Hapmap-8数据库、1000Genomes、YanHuang(YH)。首先针对每个家系中每个样本的变异与各个数据库分别比对，筛选出所有数据库均没有报道的罕见变异；然后再把家系的正常人作为对照进行比对，根据疾病表型和基因型共分离的原理，筛选患者中纯合，而在父母或同胞杂合的变异，即得到候选基因的位点。对候选基因位点，选择在多物种间（大鼠、小鼠、狗、猴、鸡、象、X_嗜热病毒、斑马鱼）保守区域的5个碱基以内的插入缺失突变、剪接区、无义突变、经SIFT判定为具有蛋白质功能损害性的（damaging）的错义突变作为首选。
　　在784家系中，未发现符合上述条件的候选基因位点。在845家系中，发现了已知致聋基因CDH23的73553127位置发生的G>A突变（c.6442G>A，p.D2148N），是已在多个人种中报道过的致聋错义突变。在855家系中，发现已知致聋基因CDH23的73270943位置发生C>T突变（c.403C>T,p.Q135*），为终止突变，据多物种间序列保守性预测，可对蛋白质功能产生巨大影响。因此，845和855家系均是已知致聋基因CDH23突变导致的，其中c.6442G>A为已知突变，c.403C>T为新突变。
　　二、CDH23基因新突变验证及分子流行病学研究
　　855号样本经过眼科学检查，发现该患者伴发严重的视网膜色素变性，符合Usher1D综合征的诊断，CDH23基因正是该疾病的负责基因。在100例正常人群对照中，筛查c.403C>T，未发现该突变。
　　本课题组收集到来自中国北方地区的108余例隐性遗传聋核心家系（包括855家系），进行常见隐性耳聋基因GJB2、SLC26A4的全测序研究，筛查了线粒体DNAA1555G，未发现携带已知突变。
　　鉴于CDH23基因为非综合征型遗传性耳聋（NSHL）较为常见的致病基因，经文献复习，查找到与NSHL中隐性耳聋DFNB12相关的CDH23基因29个突变，广泛分布于美国、德国、荷兰、日本、印度、巴基斯坦和阿尔及利亚等世界范围内的高加索人、非洲人和蒙古人种，人种间突变谱差异较大。
　　利用Sequenom公司的基于质谱原理的MassARRAY?时间飞行质谱生物芯片系统，在108个家系的患者中进行了CDH23基因与DFNB12相关的已知突变的筛查，并在855号样本中验证了新突变的存在。结果发现：3例单等位基因突变携带者，再结合外显子测序发现的1例纯合子，则CDH23基因在该样本中的NSHL相关等位基因突变率为2.31%（5/216）。
　　第二部分隐性遗传性耳聋患者中常见致聋基因GJB2和SLC26A4基因型与表型关联分析
　　一、295例GJB2双等位基因突变耳聋基因型表型分析
　　缝隙连接蛋白编码基因GJB2是非综合征型感音神经性耳聋(NSSHI)最常见的致病基因。该基因已有超过100种以上的突变被报道与耳聋相关，耳聋级别表现从轻中度到极重度均有覆盖。为评估中国人群中GJB2基因型对耳聋表型的影响，本研究在中国北方NSSHI人群中进行了横断面研究。
　　本研究纳入了295例携带GJB2双等位基因突变的中国北方七省的遗传性耳聋患者。以突变是否导致基因功能缺失将突变分为截短型（T）和非截短型（NT），将双等位基因型分为截短组（T+T），复合杂合截短组(T+NT)，和非截短组(NT+NT)。每个基因型组的耳聋纯音测听平均听阈（PTA）进行了χ2卡方检验。发现截短组的耳聋程度显著超过非截短组。同时发现具有基因型c.[79G>A;341A>G]+[79G>A;341A>G]或c.[109G>A]+[79G>A;341A>G]的患者其耳聋程度显著轻于c.235delC纯合子组，而具有c.[235delC]+[176_191del16]基因型的患者则显著重于c.235delC纯合子组。
　　二、272例儿童大前庭水管患者的基因型表型分析
　　本研究拟初步绘制儿童大前庭水管综合征患者的基因突变谱，并阐释其基因型对耳聋及内耳结构的影响。
　　12岁以下的272名大前庭水管综合征患儿纳入研究，进行了SLC26A4基因测序。其中266例接受了全套听力学检查，可获得平均听阈的数据，这其中，有152例患儿的高分辨率颞骨CT进行了详细测量。根据患者携带突变数量，分为双等位基因型，单等位基因型和无突变型，其中双等位基因型，再根据突变性质，分为双等位基因截短组，双等位基因复合杂合截短组，双等位基因非截短组。临床表型数据包括PTA，每个族群患者数量，前庭水管中段和外口直径等。
　　使用统计学软件SPSS15.0，将基因型数据和表型数据进行了关联分析，使用方法为计量资料t检验和计数资料卡方检验。
　　本组研究人群中，共发现SLC26A4基因的69种突变，其中2种为新突变(c.665G>T和c.1639A>G)。207例患者为双等位基因突变，56例为单等位基因突变，8例未发现突变，1例携带3个突变。经过统计学比较，发现单等位基因组的患者耳聋程度更为稳定(P<0.05)。双等位基因非截短组的患者比双等位基因截短组，复合杂合截短组和单等位基因组更容易出现气骨导差(所有P值<0.05)。
　　不同基因型组之间的前庭水管尺寸则没有明显差异(所有P值>0.05)。不同前庭水管尺寸的患者之间耳聋严重程度也没有明显差异(所有P值>0.05)。
　　本研究发现前庭导水管综合征的儿童中98%携带SLC26A4基因突变。虽然本研究发现了基因型与表型之间的一些关系，但是真正揭示基因型对表型的影响还有很远的距离。

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英文缩略词表

中文摘要

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前 言

第一部分 利用外显子测序技术发现隐性遗传性耳聋家系致聋基因CDH23

引 言

第一章 外显子测序在3个隐性遗传聋家系的应用

第二章 CDH23基因新突变验证及分子流行病学研究

第二部分 隐性遗传性耳聋常见致聋基因型与表型关联分析

第一章 295例GJB2双等位基因突变耳聋基因型与表型关联分析

第二章 272例大前庭水管综合征儿童中SLC26A4基因型与表型关联分析

综述一

参考文献

综述二

参考文献

个人简历

博士期间参与的课题

致谢