乙型肝炎病毒前S基因突变对慢性乙肝患者肝纤维化进展影响的研究

摘要

目的:研究HBV基因前S区突变与慢性HBV感染临床进展(肝纤维化、肝硬化)之间的关系,寻找可能有意义的突变位点,进行突变对HBV功能性改变的研究,帮助阐明HBV慢性感染肝纤维化进展的机制。
　　方法:⑴横向对比研究:选取慢性HBV感染者469例,其中352例为慢性乙型肝炎(CHB)患者,肝硬化失代偿期(dLC)117人。CHB患者均行肝穿病理检查,纤维化分级(F)0–1有119人,F2–4有233人。提取血清HBVDNA,PCR扩增前S区进行测序比对,寻找与有意义的突变。
　　⑵构建前S2缺失突变株和相应的野生株HBV复制子。选择发生率较高的前S2缺失株(nt16–54)血清样本,构建成 pTriEx-preS2缺失株和野生株质粒,转染HepG2细胞,72 h后检测细胞中的病毒复制中间体水平评价病毒复制力,检测pgRNA水平评价病毒转录,以及检测上清中的HBsAg、前S2抗原、前S1抗原和HBeAg水平评价病毒蛋白表达。
　　⑶选取6例肝穿患者,进行血清前S扩增、克隆,提取肝组织中HBV cccDNA后进行前S区扩增,并测序比对。
　　结果:⑴横向研究提示:①前S基因缺失突变结果:469例患者中,检出前S基因缺失突变者59例(12.6％),其中CHB组34例(9.7%)、dLC组25例(21.4%),差异有显著统计学意义(P=0.002)。CHB组患者中,F0–1组突变者5例(4.2%)、F2–4组29例(12.4%),具有显著统计学差异(P=0.013)。②前S2起始密码子突变结果:检出突变者55例(11.7%),其中CHB组30例(8.5%)、dLC组25例(21.4%),差异有显著统计学意义(P<0.001)。CHB组患者中,F0–1组突变5例(4.2%),F2-4组25例(10.7%),差异有显著统计学意义(P=0.043)。③前S基因点突变分析:共检出常见突变基因位点31个,T2931等突变率在dLC组患者中明显高于CHB患者、基因B型患者中高于C型患者。④多因素分析结果:年龄、基因型、前S基因缺失突变、前S2起始密码子突变,以及T2857、C2931、G2950、C3116、A3120、A109突变等指标是失代偿期肝硬化的独立预测因素;基因型是慢性肝炎重度肝纤维化(F2–4)的独立预测因素。
　　⑵功能学实验表明:pTriEx-preS2缺失株复制子转染的HepG2细胞后上清分泌HBsAg、HBeAg和preS1蛋白的水平与野生株复制子转染的HepaG2细胞相比,差异无统计学意义;上清的HBV DNA载量和细胞内的病毒复制中间体水平略高于野生株,差异无统计学意义;上清分泌 preS2蛋白的水平则显著低于野生株,差异有统计学意义。细胞内HBV RNA定量检测显示两者在3.5kb pgRNA、2.4kb mRNA、2.1kb mRNA水平比较差异无明显统计学意义。
　　⑶对6例患者血清HBV前S基因扩增、克隆以及肝组织HBV cccDNA前S基因扩增后测序,显示外周血存在缺失的患者在肝组织中均可检测到。
　　结论:随着疾病的进展,HBV前S区缺失频率检出明显增加,前S区缺失可能与慢性HBV感染临床转归(即乙肝肝纤维化)密切相关,前S2缺失株复制子转染HepG2细胞上清前S2抗原水平较野生株复制子转染上清前S2抗原水平显著降低。前S基因缺失可以存在于肝细胞内的HBV cccDNA池中。

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前言

第一部分 乙型肝炎病毒基因前S区突变对慢性乙肝患者肝纤维化进展的影响的横向研究

材料与方法

一、研究对象

二、HBV DNA提取

三、HBV前S基因扩增测序策略

四、电泳：

五、PCR产物测序

六、测序结果分析

七、统计学方法

结果

一、入组患者临床资料：

二、前S基因缺失突变者特点分析

三、前S2起始密码子突变者特点分析

四、入组患者前S基因点突变情况

六、多因素分析

讨论

小结

第二部分 构建前S2缺失突变株重组体及其突变株相应功能学改变的研究

材料与方法

一、研究对象

二、实验材料及仪器

三、实验步骤

结果

讨论

第三部分血清样本前S突变与对应肝组织样本cccDNA前S突变的比较

材料和方法

一、研究对象

二、实验材料及仪器

三、实验步骤

结果

讨论

参考文献

文献综述：乙型肝炎病毒基因突变与临床疾病进展的关系

攻读学位期间发表文章与国际会议论文交流情况

致谢