体外诱导人脐带间充质干细胞分化为表皮样细胞

摘要

目的:本课题探讨人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord-DerivedMesenchymal Stem Cells，hUC-MSCs)的分离、培养以及对其生物学特性的鉴定。构建胶原-壳聚糖支架材料，同时检测其生物学特性。利用hUC-MSCs的多向分化特性，探索由hUC-MSCs和胶原-壳聚糖支架构建的3D环境结合气-液培养的方式是否可诱导hUC-MSCs分化成表皮样细胞，并构建成表皮替代物，用于大鼠全层皮肤损伤的治疗。
　　方法:1.采用组织块培养法来分离，培养原代hUC-MSCs。采用相差显微镜观察细胞形态特征，采用流式细胞仪鉴定hUC-MSCs表面标志物，采用成脂，成骨诱导实验检测hUC-MSCs的多向分化潜能。
　　2.采用冷冻干燥、交联的方法制备胶原-壳聚糖支架材料，将hUC-MSCs接种到胶原-壳聚糖支架材料上，以构建富含生物活性的支架材料。一次接种细胞4h后，待细胞进入支架中，二次将hUC-MSCs接种到活性支架表面上。在正常培养条件下，培养2d，然后培养条件转变为气-液培养，分别于气-液培养7d，14d。利用免疫组化和western blotting的方法检测气-液培养7d，14d细胞角蛋白19(CK19)和外皮蛋白的表达情况。
　　3.构建直径为1 cm的SD大鼠全层皮肤损伤模型，分为三个不同的处理组:表皮替代物组，单纯支架材料组，空白对照组，观察不同处理组的创面愈合情况，并进一步通过组织学的方法（HE染色）检测大鼠皮肤修复情况。采用荧光染料示踪的方法检测移植入的细胞的去向。
　　结果:1.组织块培养法分离的hUC-MSCs的细胞形态呈长梭形，旋涡状生长。流式细胞仪检测显示细胞阳性表达CD90， CD105， CD73，阴性表达CD34， CD45， HLA-DR，和CD11α。诱导分化实验结果显示细胞能够向成脂细胞和成骨细胞分化，说明分离的细胞具有多向分化的潜能。
　　2.对构建的胶原-壳聚糖支架材料的功能进行评测，结果显示生物材料具有100μm～200μm的孔径，孔隙率约为90％，具有良好的溶胀率，生物可降解性和生物相容性，可用于细胞培养。
　　3.hUC-MSCs接种到胶原-壳聚糖支架材料中，细胞在材料中分布均匀，活性良好，且细胞和细胞分泌的细胞外基质等都参与构建生物活性海绵支架。hUC-MSCs在生物活性支架上采用气-液培养的方式，hUC-MSCs向表皮样细胞分化，western blotting和免疫组织化学的方法检测气-液培养7d，14d细胞角蛋白19和外皮蛋白的表达阳性。
　　4.大鼠全层皮肤损伤修复实验结果证实:在体外气-液培养7d的细胞构建的表皮替代物组虽然不能显著加速大鼠创面的愈合速度，但是组织学检测结果显示hUC-MSCs可促进表皮的再生和毛囊新生，细胞体内示踪实验证实，植入创面的表皮替代物在植入后的21d，其表皮替代物内的细胞仍然存活，但其发挥作用的机制尚不清楚，还有待进一步研究。
　　结论:体外由hUC-MSCs接种到胶原-壳聚糖支架材料中构建的生物活性支架，联合采用气-液培养的方式，模拟皮肤表皮细胞生长的微环境，可以诱导hUC-MSCs向表皮样细胞分化，并且由此构建的表皮替代物来修复大鼠全层皮肤损伤，可促进表皮的再生和毛囊新生。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 人脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分 人脐带间充质干细胞在胶原-壳聚糖支架材料中培养

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分 模拟皮肤微环境诱导人脐带间充质干细胞分化为表皮样细胞

材料和方法

结果

讨论

小结

第四部分 表皮替代物促进大鼠全层皮肤创面愈合

材料和方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

综述 间充质干细胞与创面修复

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