CXCR-4基因转染联合VCAM-1抗体包被促MSCs归巢及其对实验性IBD小鼠肠黏膜修复机制研究

摘要

研究背景:炎症性肠病（IBD）是一类肠道非特异性炎症疾病，主要包括未定型结肠炎(Indeterminate Colitis)、渍疡性结肠炎(UC)及克罗恩病(CD)。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是发生于骨髓中一种非造血类的干细胞，具有容易获取及无伦理学障碍、再生与多向分化潜能、低免疫原性及免疫调节等众多优点，且具有促进IBD损伤肠黏膜愈合并矫正黏膜免疫功能异常的作用，因而成为干细胞治疗IBD的首选细胞。前期的实验发现经静脉移植的BMSCs迁移并定植于病变肠道的数量有限，限制了其治疗作用的发挥。由于干细胞的归巢行为涉及多种趋化因子及其受体，黏附分子对等的参与。研究表明趋化因子CXC亚组受体-4/基质细胞衍生因子-1(CXCR4/SDF-1)与血管细胞粘附分子-1/人迟现抗原-4(VCAM-1/VLA-4)分子对在促干细胞归巢中发挥着十分重要的作用。故利用CXCR-4基因转染联合VCAM-1抗体包被BMSCs，能够使其在体内实现治疗的靶向性和高效性。
　　实验目的:通过构建CXCR-4基因修饰BMSCs、VCAM-1抗体包被BMSCs及CXCR-4基因修饰联合VCAM-1抗体包被BMSCs，来提高BMSCs在移植治疗实验性IBD小鼠模型中的局部定植率及疗效，并探讨其促进肠黏膜愈合的机制，为临床上采取何种靶向方式治疗IBD提供理论依据。
　　实验内容:
　　1、探讨BMSCs移植治疗实验性IBD小鼠促损伤肠黏膜修复的免疫机制。
　　2、构建并鉴定BMSCs、CXCR-4、VCAM-1靶向性及双重靶向性BMSCs及评估其体外迁移率。
　　3、观察CXCR-4及VCAM-1能否促靶向性BMSCs向IBD小鼠损伤肠黏膜定向迁移并加快肠黏膜愈合。
　　4、探讨靶向性BMSCs通过何种机制在肠道局部大量定植并发挥修复作用。
　　实验方法:
　　1、利用前期研究留取的实验性IBD小鼠及经BMSCs治疗后的血清标本，采用流式细胞技术检测Th1相关细胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α，Th2相关细胞因子IL-4、IL-10及Th17相关细胞因子IL-6、IL-17的水平。
　　2、利用前期研究留取的实验性IBD小鼠及经BMSCs治疗后的肠道组织标本，采用Real time PCR及流式细胞技术检测Th1/Th2/Th17相关细胞因子的水平。
　　3、采用Real time PCR及Western Blot技术检测肠道组织内Th1的主要调控因子T-bet、Th2的主要调控因子GATA-3、Th17的主要调控因子ROR-γt及Treg相关细胞因子TGF-β及主要调控因子Foxp3、Smad2的RNA及蛋白的表达情况。
　　4、采用骨片法从雄性BALB/C小鼠（2-3周龄）的骨片中分离并体外培养BMSCs（标记为MSC组）;将携带CXCR-4的慢病毒转柒入BMSCs构建成CXCR4-BMSCs（C-MSC组）;利用抗体包被技术将兔抗小鼠VCAM-1抗体包被于BMSCs表面构建成VCAM1-BMSCs(V-MSC组);采用基因转染联合抗体包被技术构建CXCR4-VCAM1-BMSCs(C-V-MSC组);采用Real time-PCR检测并比较CXCR-4的表达量;采用Real time-PCR及流式细胞技术检测并比较VCAM-1的表达量。
　　5、通过四组BMSCs的形态学观察、计数法测定生长曲线、成骨成脂诱导分化鉴定、流式细胞技术检测BMSCs表面标志物、细胞周期、细胞凋亡及台盼蓝染色法测定活细胞率，来比较四组BMSCs生物学特性的变化。
　　6、通过Transwell体外向SDF-1及含20％血清培养基迁移的实验，比较四组BMSCs的迁移率。
　　7、选择雌性BALB/C小鼠（6-8周龄），分别随机分为6组;并将构建好的四组BMSCs标记CM-Dil示踪:(1)对照组（标记为Control, Ctr组）:生理盐水灌肠（100μl/只），灌肠后第2天，给予尾静脉注射不合BMSCs的PBS0.1ml，n=21;(2) TNBS组（T组）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌肠剂（100μl/只），并于造模后第2天，给予尾静脉注射不含BMSCs的PBS0.1ml，n=21;(3) TNBS-MSC移植组（MT组）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌肠剂（100μl/只），并于造模后第2天，尾静脉注射含BMSCs（1×106/只）的PBS0.1ml，n=21;(4) TNBS-C-MSC移植组（CMT组）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌肠剂（100μl/只），并于造模后第2天，给予尾静脉注射含CXCR4-BMSCs（1×106/只）的PBS0.1ml，n=21;(5)TNBS-V-MSC移植组（VMT组）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌肠剂（100μl/只），并于造模后第2天，给予尾静脉注射含VCAM1-BMSCs（1×106/只）的PBS0.1ml，n=21;(6) TNBS-C-V-MSC移植组（CVMT组）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌肠剂（100μl/只），并于造模后第2天，给予尾静脉注射含CXCR4-VCAM1-BMSCs（1×106/只）的PBS0.1ml，n=21。移植当天标记为D0，移植后第1-13天，分别记为D1-13。
　　8、观察各组小鼠一般情况、体重变化及存活率、进行疾病活动度指数(TheDisease Activity Index，DAI)评分、放大镜下管观察结肠大体形态、测量结直肠长度及进行组织病理学。
　　9、分别于D0、D1、D3、D5、D7、D9、D11、D13天，脱颈处死小鼠3只/组，并取材血液、肠道组织、肠系膜淋巴结及脾脏，一部分进行石蜡包埋，一部分经液氮速冻后，-80℃冰箱保存。
　　10、荧光显微镜下观察BMSCs在肠道内的定植情况，及Real time PCR检测并比较Y染色体的性别决定区段(SRY)基因的肠道局部的相对量。
　　11、采用免疫组织化学检测细胞增殖核抗原Ki67、血管生成指标eNOS、肠道上皮间的紧密连接蛋白Claudin-1及JAM-1的表达情况。
　　12、采用Western Blot技术检测溶菌酶(Lysozyme)、TLR-4、MyD88、TRAF-6、ERK1/2、JNK1/2、MAPK及NF-κB的表达情况。
　　13、采用流式细胞技术检测肠道组织VCAM-1(CD106)的表达情况。
　　14、采用Elisa技术检测肠道组织VLA-4的表达情况。
　　实验结果:
　　1、血清中Th1相关促炎性细胞因子(IL-2、IFN-γ及TNF-α)和Th17相关促炎性细胞因子（IL-6及IL-17）的水平在造模组中明显升高;在BMSCs移植组中明显降低。Th2相关抑炎性细胞因子(IL-4及IL-10)的水平在造模组中无明显变化，在BMSCs移植组中明显升高。
　　2、局部肠道组织中Th1、Th17相关促炎性细胞因子的水平在造模组中明显升高;在BMSCs移植组中明显降低。Th2相关抑炎性细胞因子及Treg相关抑炎性细胞因子(TGF-β)的水平在造模组中无明显变化，在BMSCs移植组中明显升高。
　　3、局部肠道组织中调控因子T-bet(Th1)及ROR-γt(Th17)的表达在造模组中明显升高;在BMSCs移植组中明显降低。GATA-3(Th2)和Foxp3(Treg)的表达在造模组中无明显变化，Smad2(Treg)的表达在造模组中降低;在BMSCs移植组中明显升高。
　　4、将CXCR-4基因孚入BMSCs后，可检测到C-MSC组高表达CXCR-4;将VCAM-1抗体包被于BMSCs后，可检测到V-MSC组高表达VCAM-1;将VCAM-1包被于CXCR-4转染的BMSCs后，可检测到C-V-MSC组同时高表达CXCR-4及VCAM-1，且CXCR-4的表达量高于C-MSC组，VCAM-1的表达量高于V-MSC组。
　　5、观察四组BMSCs均呈长梭形并束状排列;生长曲线均为S形;成脂肪转化率均在60％左右;骨结节的个数在20个左右/视野;细胞表型鉴定未发生改变(CD105+，CD90+，CD11b-，CD45-);活细胞比率均在90％以上;以上结果无明显的差异;在细胞周期检测中发现过表达CXCR-4的BMSCs复制期增多;在细胞凋亡检测中发现V-MSC组及C-V-MSC组细胞凋亡率增加。
　　6、体外迁移实验证实:在SDF-1的诱导下，C-MSC组的迁移率＞C-V-MSC组＞V-MSC组＞MSC组;在20％FBS诱导下，C-V-MSC组的迁移率＞C-MSC组＞V-MSC组＞MSC组。
　　7、TNBS诱导的实验性IBD模型，小鼠精神状态差、体重减轻及存活率明显下降，DAI及组织病理学评分明显上升，肉眼观察见结直肠明显缩短、缩窄，伴有充血、出血，病理见糜烂、溃疡形成、大量中性粒细胞浸润于黏膜及黏膜下层，与正常组比较均有明显差异;MT组、CMT组、VMT组及CVMT组移植后第2天，与T组相比，临床症状好转、体重及存活率开始上升，DAI及组织病理学评分下降，肉眼观察结直肠充血、出血及缩窄情况减轻;CVMT组症状缓解、体重恢复及组织病理学改变较其他治疗组快。
　　8、荧光显微镜下可见MT组、CMT组、VMT组及CVMT组的结肠组织均存在红色荧光;四组BMSCs移植组及雄性组的肠道黏膜组织中均能检测到SRY基因;体内定植率C-V-MSC组＞C-MSC组＞V-MSC组＞MSC组。
　　9、免疫组织化学染色结果显示:IBD模型小鼠接受BMSCs移植后，肠黏膜内Ki67、eNOS、Claudin-1及JAM-1的表达量较未接受BMSCs移植组有所升高。
　　10、Western Blot的结果显示:TLR-4、MyD88、TRAF-6及NF-κ3在T组(D0)中表达量增加，MT、CMT、VMT及CVMT组D3天肠道组织内TLR-4、MyD88、TRAF-6及NF-κB的表达量较T组均下降，尤其以CVMT组下降最明显。Lysozyme在T组中表达量下降，治疗组均升高，以CMT组及VMT组升高明显。ERK1/2及JNK1/2在T组中相对表达量下降，MAPK的表达量升高;与T组相比，MT组、CMT组、VMT组及CVMT组，ERK1/2及JNK1/2的蛋白表达量均升高，MAPK蛋白的表达量降低，以CVMT组降低最为明显。
　　11、检测肠道内VCAM-1/VLA-4的含量结果显示:Control组为41.75％;T组下降为18.73％; BMSCs移植组不同程度地升高，CVMT组(73.51％)＞VMT组(67.10％)＞CMT组(66.55％)＞MT组(51.42％)。Control组中含有一定量的VLA-4，D3天时，T组升高;MT、CMT、VMT及CVMT组较T组的含量减少，减少程度为CVMT组＞VMT组＞CMT组＞MT组;D7天时含量基本恢复正常，无差异。
　　实验结论:
　　1、BMSCs能够通过抑制促炎性细胞因子、促进抑炎性细胞因子的分泌及恢复Th1/Th2及Th17/Treg细胞的平衡，来调控实验性IBD小鼠的全身及局部免疫状态。
　　2、利用CXCR-4基因转柒及VCAM-1抗体包被BMSCs，几乎不会改变BMSCs的生物学活性，且二者在BMSCs表面可协同表达。
　　3、体内外实验均证实了靶向组BMSCs的迁移率增加，且CXCR-4及VCAM-1可协同强化BMSCs的迁移特性。
　　4、在BMSCs移植治疗实验性IBD小鼠时，定植率与疗效呈正相关，并且可通过抑制过度激活的TLR/MyD88/TRAF6/NFκB信号通路，来促肠黏膜再生、修复、血管生成及上皮屏障重建。
　　5、VCAM-1/VLA-4黏附分子对及CXCR-4/SDF-1趋化因子对通过TLR4/NFκB及ERK/JNK/MAPK信号通路发挥促迁移、定植及免疫抗炎作用。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分： BMSCs移植促IBD小鼠损伤肠黏膜修复的免疫机制探讨

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分：BMSCs、CXCR-4、VCAM-1靶向性及双重靶向性BMSCs的构建与鉴定及体外迁移实验

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 CXCR-4及VCAM-1促靶向性BMSCs向实验性IBD小鼠损伤肠黏膜定向迁移及修复的机制探讨

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文小结

文献综述 间充质干细胞靶向性治疗炎症性肠病的新策略

攻读学位期间发表文章情况

致谢