沉默信号调节因子及迷迭芳酸对鼻黏膜炎症晚期炎症因子HMGB1的影响作用

摘要

慢性鼻窦炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）是鼻部常见病和多发病，欧洲鼻窦炎鼻息肉诊疗意见书(2012)报道慢性鼻窦炎患病率达10.9％，文献报道鼻息肉术后复发率高达55％，严重影响患者生活和工作，加重了社会经济负担。CRSwNP是鼻腔鼻窦黏膜慢性炎性病变，研究发现其发病因素包括:感染、变态反应、基因表达异常、细胞因子作用等(TNF-α、白介素以及白三烯等)。损伤相关分子模式(DAMPs)是近年发现的炎症诱导方式，与受体结合被免疫细胞识别后，刺激下游炎症通路，释放促炎因子，诱导炎症反应，已知的DAMPs家族，包括PLUNC和HMGB1。前期研究发现高迁移率族蛋白1(HMGB1)，作为“晚期炎症因子”，高表达于鼻息肉组织，脂多糖可诱导鼻黏膜上皮细胞核内HMGB1主动迁移至胞质，释放至细胞外，其主动迁移过程与乙酰化作用相关，因而我们从具有去乙酰化作用的沉默信号调节因子着手，研究对鼻黏膜炎症的影响作用。
　　沉默信号调节因子(silent information regulator2，Sir2)是第三类组蛋白去乙酰化酶，其7个家族成员(Sirt-7)中Sirt1蛋白能通过减少细胞因子及减轻细胞因子作用于后产生的病理损伤来抑制炎症反应。在体外实验中，鼻息肉和正常鼻黏膜组织中均有Sirt1表达，且正常鼻黏膜中Sirt1 mRNA水平比鼻息肉高5-7倍，但Sirt1在正常鼻黏膜及鼻息肉的发病机制中的作用尚未被阐述。该研究将通过体外鼻黏膜上皮细胞培养、siRNA干扰沉默Sirt1，探讨在鼻黏膜炎症过程中Sirt1如何调控HMGB1表达和释放。
　　细胞外的HMGB1与toll样受体(TLR4)结合导致NF-kB通路激活、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路磷酸化，诱导炎症因子释放，HMGB1结合TLR4受体是其主要的炎症反应通路。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)，是一种酚酸类化合物，体外试验中发现迷迭芳酸可以抑制toll样受体和MAPKs信号通路起到抑制炎症的作用。还可通过抑制IκB激酶来抑制NF-κB信号通路，下调HMGB1的袁达，进而抑制炎症反应。本研究通过迷迭香酸作用于脂多糖诱导的原代鼻黏膜上皮细胞，观察迷迭香酸在鼻黏膜炎症反应中的作用。
　　第一部分 沉默信号调节因子1对鼻黏膜炎症晚期炎症因子HMGB1的影响作用
　　目的:初步探讨Sirt1对人鼻黏膜上皮细胞表达、释放HMGB1的影响作用。
　　方法:胶原蛋白酶消化鼻息肉标本获得原代人鼻黏膜上皮细胞，经体外培养、脂质体介导的siRNA Sirt1转染，分别于24h、48h后，利用RT-PCR检测上皮细胞表达Sirt1 mRNA、HMGB1 mRNA，采用Western blot和免疫荧光染色观察HMGB1在鼻黏膜上皮细胞的表达和定位。
　　结果:1.成功构建pEGFP-N1-Sirt1真核表达质粒，并通过脂质体转染建立鼻黏膜上皮细胞Sirt1过表达模型， Sirt1上调后，鼻黏膜上皮细胞HMGB1 mRNA及HMGB1蛋白表达减少;2.转染组鼻黏膜上皮细胞中Sirt1 mRNA表达低于对照组1.9倍(P=0.038)，HMGB1 mRNA表达高于对照组2.8倍(P=0.026)，差异有统计学意义;3.Sirt1蛋白水平在转染组低于对照组2.1倍，HMGB1蛋白高于对照组1.8倍，P值均小于0.05，差异有统计学意义;4.免疫荧光染色提示:siRNA干扰沉默Sirt1后，鼻黏膜上皮细胞表达、释放HMGB1蛋白增多，并且由胞核向胞质移位。
　　结论:1.成功构建了pEGFP-N1-sirt1真核表达质粒，并通过脂质体转染建立Sirt1过表达模型;2.sirt1蛋白表达于鼻黏膜上皮细胞，siRNA对可抑制鼻黏膜上皮细胞表达Sirt1蛋白;3.上调sirt1，HMGB1 mRNA及HMGB1蛋白表达减少，干扰沉默Sirt1后，HMGB1 mRNA及HMGB1蛋白表达增多，并且HMGB1由细胞核向细胞质移位。Sirt1蛋白表达下调可能参与诱导鼻黏膜炎性反应。
　　第二部分 迷迭芳酸对脂多糖诱导鼻黏膜上皮细胞表达HMGB1的影响作用
　　目的:初步探讨迷迭香酸(RA)对脂多糖(LPS)诱导的鼻黏膜上皮细胞炎症的影响和机制。
　　方法:胶原蛋白酶消化鼻息肉标本获得原代人鼻黏膜上皮细胞，经体外培养、脂多糖诱导48h后，更换含不同浓度迷迭香酸的培养基(0.9μM，8.1μM及27μM)继续培养48 h。MTT法检测细胞增殖率，Westem blot观察鼻黏膜上皮细胞中HMGB1蛋白表达。
　　结果:1.27μM RA细胞增殖率低于其他各浓度组，P＜0.05，差异有统计学意义。2.Westem blot显示与空白组相比，LPS诱导后鼻黏膜上皮中HMGB1蛋白表达明显增加，P＜0.05，差异有统计学意义;与LPS组相比，0.9μM RA和8.1μMRA组中鼻黏膜上皮细胞的HMGB1表达明显减少。
　　结论:低浓度(0.9μM和8.1μM)的迷迭香酸可抑制LPS诱导鼻黏膜炎症，显著抑制LPS诱导后鼻黏膜上皮细胞的HMGB1蛋白表达，提示迷迭香酸在抑制人鼻黏膜上皮细胞的炎性反应中具有重要作用。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

参考文献

第一部分 沉默信号调节因子1对鼻黏膜炎症晚期炎症因子HMGB1的影响作用

一．实验材料

二．实验方法

三．结果

四．讨论

五．结论

参考文献

第二部分 迷迭芳酸对脂多糖诱导鼻黏膜上皮细胞表达HMGB1的影响作用

一．实验材料

二．实验方法

三．结果

四．讨论

五、结论

参考文献

全文总结及展望

综述

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