新疆紫草对羟基苯甲酸香叶基转移酶基因克隆及功能研究

摘要

紫草素及其衍生物是紫草科植物的重要次生代谢产物，属于萘醌类化合物，同时也是传统中药紫草的有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护肝脏及抑制DNA拓扑异构酶等生物学活性。通常认为，紫草素类化合物是通过苯丙氨酸(PP)途径-甲羟戊酸(MVA)途径/去氧木酮糖还原(MEP)途径的复合途径而合成。在对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)的作用下，MVA/MEP途径形成的焦磷酸香叶酯(GPP)的香叶烯基转移到来自PP途径代谢产物对羟基苯甲酸(PHBA)上，形成香叶基-对羟基苯甲酸(GBA)，该化合物是生成紫草素及其衍生物的前几步反应中的重要前体。前期研究表明，PGT基因的表达与紫草素类化合物的合成直接相关，为此，充分挖掘并克隆对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)基因，可为调控紫草细胞生产紫草素类化合物及构建高效生产紫草素类化合物的代谢工程菌奠定基础。课题组前期已对新疆紫草进行了转录组测序并构建了转录组数据库，在此基础上，本研究拟深入开展PGT基因的克隆及功能研究。
　　本研究目的在于:(1)通过转录组测序数据得到PGT基因的全长序列，为揭示PGT催化机理及进行功能鉴定提供靶基因;(2)通过蛋白体外酶促反应及酵母表达菌株发酵等方法，鉴定候选基因功能，为阐释酶的生物学特性及紫草素生物合成途径奠定基础;(3)通过RT-PCR，检测PGT在新疆紫草不同细胞系，不同组织器官，不同处理因素下的表达量差异，试图揭示PGT对于紫草素生物合成的重要意义及内在联系;(4)通过构建嵌合基因并进行相应的功能验证，阐明部分同源序列功能缺失的原因;(5)通过拟南芥原生质体瞬时表达实验，对AePGTs进行亚细胞定位，并尝试阐明MVA途径及MEP途径在紫草素类化合物生物合成过程中的相互关系。
　　主要研究如下:
　　(1)在已有新疆紫草转录组高通量测序数据中，共得到17条潜在PGT基因序列，经过进一步筛选，最终得到8个候选PGT基因，继而对其进行了一系列的生物信息学分析，为后期基因的克隆及功能解析奠定基础;
　　(2)本实验成功克隆得到了6个候选PGT基因及1个已知的新疆紫草PGT基因，并分别命名为AePGT1、 AePGT2、 AePGT3、 AePGT4、 AePGT5、 AePGT6、AePGT。利用RF克隆技术成功将7个AePGTs(包括已经报道的AePGT)构建到pESC-His表达载体中，并且成功表达出相应膜蛋白，继而以GPP和PHBA为酶促反应底物，进行体外酶促反应，并通过酵母表达菌株发酵来证实体外酶促，结果表明AePGT4、AePGT6及AePGT具有催化GPP的香叶烯基转移到PHBA上生成GBA的活性。通过上述研究，成功克隆并得到了能够编码具有催化功能PGT蛋白的基因，为阐释酶的酶学学特性及紫草素生物合成途径奠定基础;
　　(3)通过RT-PCR技术，检测AePGTs在红色高产悬浮细胞系和白色低产悬浮细胞系、植株的地上部分和地下部分表达量的差异及茉莉酸甲酯(MeJA)处理对其表达量的影响，结果显示在紫草素类化合物产量较高的新疆紫草红色高产细胞系及植株的地下部分，AePGTs基因的整体表达量明显高于白色低产系及植株的地上部分;并且MeJA处理后AePGTs基因的表达量也会明显升高，且红色细胞系中的增长幅度显著高于白色细胞系，这说明新疆紫草PGT基因的表达量与紫草素类化合物的合成密切相关，且呈正相关性;
　　(4)序列比对分析发现3个与具有催化功能的PGT同源性较高的功能缺失蛋白AePGT2、AePGT3、AePGT5的N端分别缺少约50～60个氨基酸。为验证该段序列的功能，本研究将缺失的N段序列与3条功能缺失基因的全长序列通过合成的方式构建嵌合基因，并通过外源表达成功获得相应嵌合蛋白，AePGT-Cp2、AePGT-Cp3、AePGT-Cp5，继而进行体外酶促反应，结果表明3个嵌合蛋白均能够催化GPP和PHBA反应生成GBA，推测导致3个同源蛋白功能缺失的原因是其缺失的N端序列中包含一段与底物结合有关的重要结构域。
　　(5)通过拟南芥原生质体瞬时表达实验，对AePGT4、AePGT6及AePGT进行亚细胞定位，结果发现3者均为非质体膜蛋白;结合文献及紫草素类化合物合成过程中各通路发生位置，推测PGT为内质网膜蛋白。

目录

声明

摘要

英文缩略词

第1章 文献综述

1．1 紫草简介

1．2 紫草化学成分研究进展

1．2．1 萘醌类化合物

1．2．2 单萜苯酚及苯醌类化合物

1．2．3 酚酸类及其盐类

1．2．4 脂肪族和酯类化合物

1．2．5 生物碱及其他类化合物

1．3 紫草素类化合物药理作用研究进展

1．3．1 抗炎作用

1．3．2 抗病毒作用

1．3．3 抑制脂肪形成

1．3．4 抗雌激素作用

1．3．5 抗肿瘤作用

1．4 紫草素类化合物生物合成的研究进展

1．4．1 PHBA的合成

1．4．2 GPP的合成

1．4．3 对羟基苯甲酸-香叶基转移酶(PGT)

第2章 基于新疆紫草转录组的对羟基苯甲酸香叶基转移酶基因的挖掘及生物信息学分析

2．1 前言

2．2 实验材料

2．3 实验方法

2．3．1 新疆紫草PGT基因的分离

2．3．2 新疆紫草PGT基因结构分析

2．3．3 新疆紫草PGT蛋白的生物信息学分析

2．3．4 新疆紫草PGT蛋白的系统进化树分析

2．4 实验结果及分析

2．4．1 新疆紫草PGT基因的分离

2．4．2 新疆紫草PGT基因结构和表达分析

2．4．3 新疆紫草PGT蛋白特性分析

2．4．4 新疆紫草PGT蛋白结构分析

2．4．5 氨基酸序列多重比对分析

2．4．6 新疆紫草PGT蛋白系统进化树分析

2．5 实验小结与讨论

第3章 新疆紫草对羟基苯甲酸香叶基转移酶基因的克隆及功能鉴定

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 植物材料

3．2．2 载体和菌株

3．2．3 主要试剂

3．2．4 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 新疆紫草悬浮细胞培养

3．3．2 茉莉酸甲酯诱导处理新疆紫草悬浮细胞

3．3．3 RNA提取和检测

3．3．4 逆转录PCR

3．3．5 新疆紫草PGT基因全长克隆

3．3．6 DNA连接反应

3．3．7 大肠杆菌转化

3．3．8 大肠杆菌阳性克隆鉴定

3．3．9 小量质粒DNA提取

3．3．10 表达载体构建

3．3．11 酵母LiAc法转化

3．3．12 酵母外源基因诱导表达

3．3．13 小量酵母表达蛋白微粒体蛋白提取(玻璃珠法)

3．3．14 小批量酵母发酵产物中GBA的抽提及检测

3．3．15 体外酶促反应

3．3．16 体外酶促反应产物抽提及检测

3．3．17 实时荧光定量PCR引物设计

3．3．18 实时荧光定量PCR检测基因表达

3．4 实验结果与分析

3．4．1 新疆紫草悬浮细胞样品RNA提取及检测

3．4．2 新疆紫草PGT基因全长克隆

3．4．3 AePGTs在红色悬浮细胞系及白色悬浮细胞系基因表达差异分析

3．4．4 AePGTs在新疆紫革植株的地上部分与地下部分基因表达差异分析

3．4．5 小批量酵母发酵

3．4．6 体外酶促反应验证催化功能

3．4．7 MeJA诱导对AePGTs基因表达量的影响

3．5 实验小结与讨论

第4章 嵌合PGT序列编码蛋白的功能鉴定及AePGTs蛋白亚细胞定位

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 植物材料

4．2．2 载体和菌株

4．2．3 主要试剂

4．3 实验方法

4．3．1 嵌合PGT序列编码蛋白的功能鉴定

4．3．2 AePGTs蛋白亚细胞定位

4．4 实验结果与分析

4．4．1 嵌合PGT蛋白功能鉴定

4．4．2 AePGTs蛋白亚细胞定位

4．5 实验小结与讨论

结论

参考文献

致谢

硕士期间文章情况