从造血干细胞增殖及造血微环境探讨中药治疗β地中海贫血的分子机制

摘要

β地中海贫血（简称β地贫），属于常染色体隐性遗传血红蛋白病。地贫发病机制明确，但对其治疗相对滞后。导师吴志奎教授基于“肾生髓、髓生血”理论，用“补肾益髓”法在地贫高发区治疗β地贫取得了肯定疗效。
　　本论文的主要内容是在深入学习传承导师“补肾益髓”治疗地贫理论和临床实践经验，总结前期工作的基础上，首次在高发区开展“补肾益髓”治疗β地贫随机、双盲、安慰剂对照规范临床研究并对其疗效的可能机制提出研究假说，认为“补肾益髓”治疗地贫发挥疗效的可能机制是通过改善造血微环境，调控骨髓造血干细胞增殖分化、影响DNA甲基化表观遗传修饰，进而促进骨髓有效造血实现的。通过分离培养骨髓造血干细胞、间充质干细胞，采用RT-PCR检测珠蛋白基因表达调控，利用Western blot，DNA甲基化芯片，透射电镜等现代生物信息学技术，体内外实验相结合，验证假说的客观性。
　　研究目标：
　　开展补肾益髓治疗β地贫临床规范研究;并从改善造血微环境，调控骨髓造血干细胞增殖分化，影响DNA甲基化修饰等方面对其促进骨髓有效造血的疗效机制进行深入研究，侧面揭示“肾生髓、髓生血”的理论内涵。
　　本项课题围绕着研究目标从临床和实验两个部分展开研究。
　　1.补肾益髓治疗地贫的临床研究
　　1.1 地贫患者中医证候分布规律调查
　　调查中医肾虚证候（肾精亏虚证、肾阴虚证、肾阳虚证）在地贫患者中的具体分布，中医肾虚症候积分与基因型的关系以及在地贫患者中的差异，为益髓生血颗粒临床辨证治疗地贫提供依据。
　　1.2 益髓生血颗粒治疗β地贫临床规范研究
　　采用随机对照试验（随机双盲安慰剂平行对照），临床试验前在国际临床研究注册网站进行注册。对治疗前后患者的中医症候量化评分，连续观察血液指标动态变化，以国际公认的诊断与疗效标准，采用第三方统计分析对治疗结果进行评价。
　　2.补肾益髓治疗地贫的机制研究
　　主要围绕着益髓生血颗粒治疗地贫改善骨髓造血微环境，调控骨髓造血干细胞增殖分化以及影响DNA甲基化表观遗传修饰，进而促进骨髓有效造血展开。
　　研究方法及结果：
　　1.临床研究方法及结果
　　1.1 地贫患者中医证候分布规律调查
　　地贫患者中医证候调查结果显示，在调查的所有患者中，以肾阴虚证195例最为多见，其次为肾精亏虚证89例，肾阳虚证所占比例较少。涉及的26项中医肾虚症侯出现的频率以面色萎黄、盗汗、口唇淡白、神疲乏力、咽干、口干多见，地贫患者阴血亏虚见面色萎黄、口唇淡白;血虚则气弱，神疲乏力;阴虚则见盗汗、口干、咽干。β地贫患者基因型为纯合子或杂合子的肾虚症候积分无统计学差异。
　　1.2 益髓生血颗粒治疗β地贫高发区临床规范研究
　　采用随机、双盲、安慰剂平行对照方法，对患者中医症候量化评分，动态观察临床血液指标变化，由第三方编盲与第三方统计，以国际公认的诊断与疗效标准，对临床治疗结果进行评价。入组40例β地贫患者，随机分为实验组和对照组，实验组给予益髓生血颗粒，对照组给予安慰剂，疗程12周。
　　益髓生血颗粒治疗β地贫结果显示，治疗第4周、8周、12周实验组有效率分别为47.06％，47.06％和58.82％;对照组有效率分别为11.11％，5.56％，5.56％;两组有效率比较，三个时间点实验组与对照组有效率比较均有显著的统计差异（4周p＜0.05，8周p＜0.01，12周p＜0.01）。该研究在国内外β地贫临床研究中为首次完成。
　　2.实验研究方法及结果
　　2.1 益髓生血颗粒治疗地贫对患者骨髓造血干细胞增殖的影响
　　(1)研究显示，5例患者疗后骨髓CD34+细胞体外培养自第2日开始，增殖较快，至第7日疗后CD34+细胞增殖OD值为0.62，较疗前骨髓CD34+细胞增殖明显提高(p＜0.01)。提示益髓生血颗粒治疗地贫可显著促进患者内源性骨髓CD34+细胞增殖。
　　(2)研究还对不同类型（α型，β型）的两对双胞胎地贫患儿，进行了遗传背景与临床疗效、骨髓CD34+细胞的增殖能力关系的比较分析。
　　1)结果发现，同卵双生β地贫患儿（基因型β41-42/β-28）与异卵双生α地贫患儿(基因型——SEA/αCSα，——SEA/α4.2α)，遗传背景不同其临床疗效及骨髓CD34+细胞的增殖能力有明显差异。α型地贫双胞胎患儿较β型地贫双胞胎患儿临床贫血症状轻，经益髓生血颗粒治疗后，疗效优于β地贫双胞胎患儿;α地贫双胞胎患儿骨髓CD34+细胞的增殖能力高于β型地贫双胞胎患儿。
　　2)β地贫遗传背景完全相同(基因型β41-42/β-28)，骨髓CD34+细胞体外增殖情况个体差异较大，在临床贫血较轻的患者，其骨髓CD34+细胞的增殖能力较强。α地贫患儿疗后骨髓CD34+细胞增殖能力随时间变化提高明显，基因型—-SEA/αCSα（缺失、突变）患儿骨髓CD34+细胞增殖能力较基因型——SEA/α4.2α(缺失型)患儿更为明显。上述研究结果在中药治疗地贫研究中为首次完成。
　　2.2 益髓生血颗粒含药血清诱导红系分化研究
　　研究通过半固体集落培养方法，观察益髓生血颗粒含药血清高、中、低各浓度对骨髓CD34+细胞分化集落的影响;同时以K562细胞为研究对象，用益髓生血颗粒含药血清培养K562细胞，采用联苯胺染色和RT-PCR技术观察益髓生血颗粒诱导K562细胞向红系分化的作用。
　　结果显示益髓生血颗粒含药血清作用第13天，BFU-E集落数量与对照组比较，高剂量组呈现明显的促进集落分化的作用(p＜0.001);低剂量组与中剂量组集落数高于对照组，但差异无统计意义(p＞0.05)。益髓生血颗粒高剂量含药血清能够促进K562细胞α和γ珠蛋白基因表达(p＜0.05)。
　　研究结论：
　　1.临床研究
　　1.1 α地贫和β地贫临床均存在肾虚表现，以肾阴虚证最为多见，基本证型为肾精血不足、肾阴虚证。
　　1.2 随机、双盲、安慰剂平行对照评价益髓生血颗粒治疗地贫疗效，疗程结束，实验组地贫患者治疗4周、8周、12周有效率分别为47.06％，47.06％和58.82％;对照组有效率分别为11.11％，5.56％，5.56％;两组各时间节点有效率差异有统计学意义（第4周p＜0.05，第8周p＜0.01，第12周p＜0.01）。该研究在国内外β地贫临床研究中为首次完成。
　　2.疗效机制研究
　　2.1 益髓生血颗粒能够促进骨髓CD34+细胞增殖分化，促进骨髓有效造血:
　　(1)益髓生血颗粒能够促进地贫患者内源性骨髓CD34+细胞体外增殖。地贫患者骨髓CD34+细胞的增殖具有时间依赖性，随着作用时间的延长，疗后骨髓CD34+细胞增殖能力显著提高。
　　(2)遗传背景与临床疗效、骨髓CD34+细胞的增殖能力关系的比较，遗传背景不同的两对双胞胎地贫患儿，其临床疗效及骨髓CD34+细胞的增殖能力有明显差异;同类型双胞胎患儿，同卵双生β地贫患儿（基因型β41-42/β-28）疗效有个体差异，对异卵双生α地贫患儿（基因型——SEA/αCSα，——SEA/α4.2α）基因型不相同疗效也有明显差异。
　　(3)益髓生血颗粒含药血清高剂量组促进骨髓CD34+细胞分化红系集落形成，并能诱导K562细胞向红系分化。
　　(4)益髓生血颗粒组分大黄素能够促进骨髓CD34+细胞分化集落细胞γ珠蛋白基因表达。
　　2.2 益髓生血颗粒能够改善骨髓造血微环境，促进骨髓有效造血:
　　(1)益髓生血颗粒能够提高患者骨髓血血浆SCF、IL-6、G-CSF、EPO造血细胞因子含量，提高患者骨髓内红细胞SOD，GSH-PX酶活性。
　　(2)组分单体大黄素能够促进骨髓MSC细胞增殖。
　　(3)大黄素能够提高骨髓MSC细胞分泌细胞因子SCF的活性。
　　(4)益髓生血颗粒治疗β地贫有效病例全基因组DNA甲基化结果显示，两个关键基因JAK3和MAPK10可能在细胞因子诱导干细胞分化过程中起作用。
　　益髓生血颗粒能够改善骨髓造血微环境，调控骨髓造血干细胞有效造血，表现为能够促进骨髓MSC细胞自分泌细胞因子，减少早期红系集落细胞氧化损伤，促进骨髓造血干细胞增殖，促进造血干细胞早期分化集落细胞γ珠蛋白的基因表达，促进有效造血。益髓生血颗粒缓解地贫患者临床贫血症状的作用机制可能是促进骨髓有效造血，减少骨髓内早期红细胞的溶血。
　　研究结果提示，“肾生髓、髓生血”理论的现代生物学内涵可部分体现为骨髓微环境调控下的骨髓造血干细胞的增殖分化功能。
　　论文创新之处：
　　1.本研究首次在高发区完成益髓生血颗粒治疗β地贫的随机、双盲、安慰剂平行对照临床试验，进行临床研究国际注册，第三方编盲统计，以国际公认的诊断与疗效标准，对益髓生血颗粒治疗地贫进行疗效评价，在国内外β地贫临床研究中属于首次完成。
　　2.研究发现益髓生血颗粒能够促进地贫患者内源性骨髓CD34+细胞体外增殖。对双胞胎患儿研究发现，遗传背景与疗效、患儿骨髓CD4+细胞增殖密切相关，上述研究在中药治疗地贫疗效机制研究中为首次完成。
　　3.理论创新:论文基于补肾益髓治疗β地贫的明显疗效，从促进患者内源性造血干细胞增殖分化，改善造血微环境，诱导红系分化及影响DNA甲基化表观遗传修饰层面，探讨了补肾益髓治疗β地贫疗效的分子机制，从一个侧面阐释了“肾生髓、髓生血”理论的科学内涵。研究结果为难治疾病防治的现代研究提供了新思路。

目录

声明

摘要

英文缩略语

综述一 基于“肾生髓，髓生血”理论治疗β地贫的研究进展

综述二 骨髓造血微环境调控骨髓造血干细胞增殖分化的研究进展

前言

临床研究 补肾益髓治疗地贫的临床研究

第一章 地贫患者中医肾虚证候分布调查

1 研究方法

2 研究结果

3 讨论

4 小结

第二章 益髓生血颗粒治疗β地贫随机双盲安慰剂平行对照研究

1 研究对象

2 研究方法

3 研究结果

4 讨论

5 小结

临床研究讨论

临床研究小结

参考文献

实验研究 补肾益髓治疗地贫疗效分子机制研究

第一章 地贫患者内源性骨髓造血干细胞体外增殖实验

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二章 益髓生血颗粒含药血清诱导红系分化实验研究

第一节 益髓生血颗粒含药血清对骨髓CD34+细胞红系集落分化的影响

第二节 益髓生血颗粒含药血清诱导K562细胞向红系分化的影响

参考文献

第三章 益髓生血颗粒君药组分单体对造血CD34+细胞分化的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第四章 补肾益髓治疗地贫对骨髓造血微环境的影响

第一节 益髓生血颗粒治疗β地贫对骨髓血细胞因子的影响

第二节 益髓生血颗粒单体对骨髓MSC细胞增殖及分泌细胞因子的影响

参考文献

第五章 补肾益髓治疗β地贫对全基因组DNA甲基化的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

实验研究讨论

实验研究总结

参考文献

全文总结与展望

论文基金资助

致谢

个人简历

附件