几类常用外用中药成份对人皮肤成纤维细胞胶原代谢的调节作用

摘要

慢性皮肤溃疡是临床常见病，可继发或并发于多种疾病，治疗比较困难。在慢性皮肤溃疡发病过程中胶原代谢失常起着至关重要的作用。慢性皮肤溃疡创面内胶原合成能力降低和胶原分解过度，成为创面难愈合的重要原因。临床常用的外用中药有四类：祛腐类药物，如轻粉、红粉、雄黄、砒石等；活血类药物，如乳香、没药、血竭、三七、琥珀、大黄等；温补类药物，如人参、黄芪、鹿茸、肉桂等；敛口生肌类药物，如炉甘石、珍珠粉、煅石膏等。临床和动物实验均证明外用中药合理配伍运用治疗慢性皮肤溃疡疗效显著。为研究这四类药物的作用环节和机制，本论文以体外培养人皮肤成纤维细胞(humanskinfibroblasts，HSFb)为对象，选用这四类药物临床常用代表药物的有效成份：三氧化二砷(祛腐类)、血竭素和乳香水提物(活血类)、鹿茸多肽(温补类)、水溶性珍珠粉(敛口生肌类)，比较这几类中药成份对成纤维细胞胶原代谢的调节作用，明确其作用靶点和作用机制，为中医外科治疗慢性皮肤溃疡治则、遣方用药提供科学实验依据。 本文首先对胶原代谢与慢性皮肤溃疡的相关性，以及外用中药治疗慢性皮肤溃疡的研究现状进行了综述，为本论文的立题和研究奠定了基础，并在此基础上进行实验研究。 一、研究三氧化二砷(祛腐类)、血竭素和乳香水提物(活血类)、鹿茸多肽(温补类)、水溶性珍珠粉(敛口生肌类)对体外培养人皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。 方法：采用MTT比色法检测成纤维细胞增殖和羟脯氨酸试剂盒检测胶原含量。 结果显示：1、药物分别作用于HSFb48小时后，水溶性珍珠粉在1.25×102～1×103μg/ml，血竭素在5～20μg/ml，乳香水提物在0.64～2×103μg/ml，鹿茸多肽在6.25×10-3～0.4μg/ml浓度范围内对HSFb具有促增殖作用，与对照组比较差异显著(P＜0.01或P＜0.05)，三氧化二砷在0.16～0.8μg/ml浓度范围内对HSFb增殖具有抑制作用，与对照组比较差异显著(P＜0.01)。 2、药物分别作用于HSFb48小时后，水溶性珍珠粉在2.5×102～1×103μg/ml，血竭素高氯酸盐在2.5～20μg/ml，乳香水提物在0.64～2×103μg/ml，鹿茸多肽在1.56×10-3～0.4μg/ml浓度范围内对HSFb胶原蛋白合成具有促进作用，与对照组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)，三氧化二砷在3.2×10-2～0.8μg/ml浓度范围内对HSFb胶原蛋白合成具有抑制作用，与对照组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。 水溶性珍珠粉1×103μg/ml、血竭素20μg/ml、乳香水提物2×103μg/ml、鹿茸多肽0.4μg/ml促进增殖和胶原合成作用最明显，三氧化二砷0.8μg/ml抑制增殖和胶原合成作用最明显。这些浓度被作为以后的实验浓度。 二、研究三氧化二砷(祛腐类)、血竭素和乳香水提物(活血类)、鹿茸多肽(温补类)、水溶性珍珠粉(敛口生肌类)对体外培养人皮肤成纤维细胞胶原代谢的影响。 方法：采用酶谱法检测成纤维细胞分泌的MMPs活性，采用免疫细胞化学法检测TIMP-1、TGF-β1蛋白的表达。 结果显示：1、酶谱法分析结果：MMPs活性条带在SDS-PAGE电泳凝胶上呈蓝色背景上的白色透明带。根据低分子量标准蛋白鉴定，所有的HSFb上清液中均测出比较清晰的两条带，分别为：MMP-1(45kD)，MMP-2(62kD)。药物作用于HSFb48h后，水溶性珍珠粉、鹿茸多肽对HSFb分泌MMP-1、MMP-2活性没有明显作用；血竭素对HSFb分泌MMP-1、MMP-2活性有抑制作用，与对照组差异显著(P＜0.01)；乳香水提物对HSFb分泌MMP-1活性有抑制作用，与对照组差异显著(P＜0.01)，对MMP-2活性略微有抑制作用，但无统计学意义(P＞0.05)；三氧化二砷组HSFb分泌MMP-1、MMP-2活性明显高于对照组(P＜0.01)。 2、免疫细胞化学法结果：(1)TIMP-1蛋白主要为胞浆表达。对照组0、6、12、18h，各用药组0h标本，胞浆均淡染，TIMP-1表达量较低，经统计上述各组量均无差异(P＞0.05)；水溶性珍珠粉作用6h后TIMP-1表达仍较低，作用12、18h后，TIMP-1表达略有增加，但与对照组无显著差异(P＞0.05)；血竭素作用6、12、18h后，TIMP-1表达持续增加，与对照组差异显著(P＜0.01)；乳香水提物作用6、12、18h后，TIMP-1表达持续增加，与对照组差异显著(P＜0.01)，但各时相TIMP-1表达均低于血竭素组(P＜0.01)；鹿茸多肽作用6、12、18h后TIMP-1表达略有增加，但与对照组无显著差异；三氧化二砷作用6、12、18h后，TIMP-1表达持续降低，与对照组差异显著(P＜0.01)。 (2)TGF-β1蛋白主要为胞浆表达。对照组0、6、12、18h，各用药组0h标本，胞浆均淡染，TGF-β1表达量较低，经统计上述各组量均无差异(P＞0.05)；水溶性珍珠粉作用6、12、18h后，TGF-β1表达略有增加，但与对照组无显著差异(P＞0.05)；血竭素作用6、12h后，TGF-β1表达持续增加，与对照组差异显著(P＜0.01)，作用18h后，TGF-β1表达比12h有所下降，但与对照组仍差异显著(P＜0.01)；乳香水提物作用6、12、18h后，TGF-β1表达持续增加，与对照组差异显著(P＜0.01)，乳香水提物作用18hTGF-β1表达低于血竭素12h的高表达(P＜0.01)；鹿茸多肽作用6、12、18h后TGF-β1表达略有增加，但与对照组无显著差异；三氧化二砷作用6、12、18h后，TGF-β1表达持续降低，与对照组差异显著(P＜0.01)。 三、结论：慢性皮肤溃疡迁延难愈与胶原代谢失常有关，通过以上两部分实验结果证实，水溶性珍珠粉、血竭素、乳香水提物、鹿茸多肽可促进成纤维细胞增殖和胶原合成，而三氧化二砷抑制成纤维细胞增殖和胶原合成；血竭素、乳香水提物可降低MMPs活性，促进TIMP-1、TGF-β1的表达，水溶性珍珠粉和鹿茸多肽对MMPs活性、TIMP-1、TGF-β1表达无明显作用，三氧化二砷升高MMPs活性，抑制TIMP-1、TGF-β1的表达。显示几种中药主要成份对成纤维细胞胶原代谢呈现不同的调节作用，说明药物促进慢性皮肤溃疡愈合的机理可能是不同的，血竭素、乳香水提物可能通过促进胶原合成和减少胶原降解两方面促进慢性皮肤溃疡的愈合，水溶性珍珠粉和鹿茸多肽促进慢性皮肤溃疡的愈合的作用机理可能主要是促进胶原合成作用，而祛腐药三氧化二砷在本实验中的作用可能体现了它的“祛腐”作用：通过抑制成纤维细胞增殖和胶原合成，升高MMPs活性，抑制TIMP-1、TGF-β1的表达来达到清除坏死组织的作用。

目录

英文缩略词表

上篇 文献综述

下篇 实验研究

前言

第一部分几类常用外用中药成份对人皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

第二部分几种常用外用中药成份对人皮肤成纤维细胞MMPs活性及TIMP-1、TGF-β1表达的影响

结语

附图

致谢

个人简历