用转座子与RNA/DNA嵌合寡核苷酸探讨靶向性基因治疗

摘要

基因治疗是指将遗传物质导入患者体内,以使患者获得有益治疗的一种新型治疗方式.目前限制基因治疗的主要障碍是基因转移系统不能满足临床要求.在临床方案中应用较为广泛的病毒载体和非病毒载体存在的主要不足是基因转移效率达不到临床要求及载体没有靶向性.一般来说,基因治疗的靶向性分为三个水平:组织特异性的基因转移、转移基因整合的特异性及转移基因的适宜表达.近年来,很多实验室认识到其重要性并开始从事该方面研究.目前靶向性基因治疗已成为基因治疗领域热点之一.该研究以多种人源细胞系为模型,探讨了RNA/DNA寡核苷酸对基因组中与HPFH相关的位点的突变作用.结果发现嵌合体修复术可突变Aγ与Gγ基因的调控序列.通过有限稀释,筛选到靶位点已成功突变的单细胞克隆.表明该种技术可望应用于各种类型的β地贫基因治疗.另外人们发现不同细胞系对嵌合体的反应性不同.荧光标记的寡核苷酸转染试验说明寡核苷酸转染Hela、K562等细胞效率相近,但在Hela及CMK细胞中能检测到定点突变作用,而在K562及HEL细胞中却检测不到定点突变作用.提示嵌合体修复作用与细胞自身的修复系统酶系活性有关.

目录

Abstract :

前言

第一部分：转座子应用于人类体细胞靶向性基因治疗的探索性研究

第一部分前言

第一部分材料与方法

一、材料

二、实验方法

第一部分实验结果

一、转座子载体的构建

二、转座子载体共转染哺乳动物细胞系

三.PCR及Southern 分析

四.反向PCR检测转座子左臂的旁侧序列

第一部分讨论

第二部分：RNA/DNA 寡核苷酸用于β地贫的靶向性基因治疗

第二部分前言

第二部分材料与方法

1、细胞系及细胞培养。

2、寡核苷酸与转染试剂。

3、质粒构建。

4、基因转染。

5、基因组DNA的提取同第一部分。

6、PCR扩增待检测片段。

7、等位基因特异PCR（Allele specific PCR,AS-PCR)检测RNA/DNA嵌合寡核苷酸的定点突变作用。

8、寡核苷酸杂交检测RNA/DNA嵌合寡核酸的定点纠正作用。

9、限制性内切酶酶片段长度多态性分析RNA/DNA寡核苷酸的定点突变作用。

1O、定点突变克隆的筛选。

第二部分结果

一、质粒构建。

二、电穿孔法转化MEL细胞。

三、βE基因定点纠正的检测：

四、Gγ基因调控序列的定点突变。

五、定点突变克隆的筛选。

六、Aγ-202 C位点的检测。

第二部分讨论

1、β-地贫的靶向性基因治疗

2、RNA/DNA定点突变的检测方法

3、RNA/DNA定位突变的细胞特异性

4、嵌合体修复术的应用前景

小结

参考文献：

综述靶向整合研究进展

英文名词及缩写

个人简历

致谢