比较蛋白质组学筛查鉴定胰腺癌多药耐药相关蛋白的实验研究

摘要

背景：胰腺癌是消化道系统的恶性肿瘤，多数患者被发现时已是晚期，仅15～20％的患者有根治性手术切除机会。目前化疗仍然是治疗胰腺癌、改善预后和提高患者生活质量的一种重要的辅助治疗方法。然而不同患者对化疗的敏感性差异较大且存在着严重的多药耐药现象，从而导致化疗效果不甚理想。虽然国内外许多学者对胰腺癌多药耐药的机制进行了大量的研究，发现与细胞膜转运、能量代谢以及DNA损伤修复等相关的基因和蛋白在胰腺癌耐药过程中可能发挥作用，但尚不能完全解释其发生和作用的机制。既往大量的研究结果提示胰腺癌多药耐药现象的发生不是由单一基因或蛋白改变所引起，而可能是由多种基因或蛋白呈网络式共同作用的结果。本实验室在前期分别采用小剂量梯度递增法和大剂量药物冲击法建立了3株胰腺癌耐药细胞亚株，并通过基因芯片技术筛查出大量可能与胰腺癌多药耐药相关的基因，且对其中筛选出的部分基因在mRNA水平和蛋白水平进行验证。但到目前为止尚未发现何种基因在胰腺癌多药耐药的发生发展中起到了关键和决定性的作用。多药耐药的发生既是一种多基因调控的现象，也是一种多蛋白调控的现象，其发生往往与一组蛋白质而不是一个或几个蛋白的改变有关，况且基因的功能最终要由蛋白质来实现，因此本实验拟在前期研究工作的基础上，应用高通量筛查差异表达蛋白的实验技术—蛋白质组学技术，在蛋白水平筛查胰腺癌多药耐药发生过程中表达水平发生改变的蛋白质的种类、数量和修饰，希望找到在胰腺癌耐药发生过程中起到关键作用的一组蛋白质，从而对胰腺癌的多药耐药机制进行探讨，为今后寻找胰腺癌的治疗靶点或逆转多药耐药提供理论依据。 方法：1.通过CCK-8比色法检测人胰腺癌细胞株SW1990及耐药亚株SW1990/FU、SW1990/ADM和SW1990/GEM的耐药指数。 2.通过双向凝胶电泳(Two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)分离亲本株SW1990及耐药亚株SW1990/ADM和SW1990/FU的总蛋白。 3.用ImgemMster图像分析软件来检测双向电泳实验的可重复性。 4.用ImgemMster图像分析软件来分析耐药亚株SW1990/ADM、SW1990/FU及亲本株SW19902-DE图之间的相关性并筛查耐药亚株SW1990/ADM和SW1990/FU与其亲本株SW1990之间的差异表达蛋白。 5.应用质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定所筛查出的差异表达蛋白。 6.应用RT-PCR技术对筛选出的部分差异表达蛋白在mRNA水平进行验证。 结果：1.通过CCK-8比色法检测三株耐药细胞亚株SW1990/FU、SW1990/ADM、SW1990/GEM较其亲本株SW1990对相应诱导药物的耐药指数分别为339.7、11.9、56.6。 2.通过Clean-up试剂盒纯化蛋白并用Bradford法测定蛋白浓度，方法成熟稳定，上样量一致。 3.通过2-DE(银染及考染)从亲本株SW1990及其耐药亚株SW1990/ADM和SW1990/FU的总蛋白中分别分离出肉眼可见的蛋白点200余个。 4.用ImgemMster图像分析软件分析2次重复实验中2-DE图的重复性，SW1990和SW1990/ADM的重复率均为0.62；SW1990和SW1990/FU的重复率分别0.74和0.72。 5.用ImgemMster图像分析软件分析亲本株SW1990和耐药亚株SW1990/ADM及SW1990/FU2-DE图之间的线性相关系数分别为0.901和0.784。筛查出SW1990/ADM与SW1990之间差异在1.5倍以上的蛋白点73个，其中上调的蛋白点26个，下调的47个；SW1990/FU与SW1990之间差异在1.5倍以上的蛋白点97个，其中在耐药亚株中上调的蛋白点32个，下调的65个。 6.从表达差异最为显著的蛋白点中选取9个，进一步通过质谱鉴定。其中SW1990/ADM与SW1990之间差异表达蛋白有Enolase1，OTTTHUMP00000030321；SW1990/FU与SW1990之间差异表达蛋白有Enolase1，Heatshockprotein27，TriosephosphateIsomerase1和Putativeodorantbindingproteinag等。 7.通过RT-PCR技术在基因水平对HSP27的mRNA表达水平进行验证，发现HSP27mRNA表达水平在SW1990/ADM、SW1990/FU和SW1990/GEM中较亲本株均升高。 结论：1.胰腺癌耐药亚株SW1990/ADM、SW1990/FU和SW1990/GEM较其亲本株SW1990相比，具有较高的耐药性，且耐药性可稳定遗传。 2.亲本株SW1990及其耐药亚株SW1990/ADM和SW1990/FU的2-DE图的重复性较好(重复率均大于0.5)，SW1990和SW1990/ADM及SW1990和SW1990/FU的2-DE图的相关性良好，提示2-DE方法可靠。 3.胰腺癌耐药亚株SW1990/ADM及SW1990/FU与其亲本株SW1990相比，有许多蛋白在表达水平发生了显著改变。提示可能有许多蛋白参与了胰腺癌细胞对化疗药物ADM及5-FU耐药现象的发生，胰腺癌细胞的多药耐药现象可能是多种蛋白共同作用的结果。 4.经过质谱分析鉴定出Enolase1，Heatshock27，TriosephosphateIsomerase1和Putativeodorantbindingproteinag可能参与了胰腺癌多药耐药的发生。5.HSP27mRNA表达水平在SW1990/ADM、SW1990/FU和SW1990/GEM中较亲本株均升高，提示该基因可能与胰腺癌对ADM、5-FU和GEM的耐药相关。

目录

缩略词

前言

第一部分人胰腺癌细胞株SW1990与其耐药亚株药物敏感性的比较

第二部分胰腺癌多药耐药相关蛋白的筛查及鉴定

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 蛋白质组学技术的研究进展及其在肿瘤耐药研究中的应用

致谢