一种基于家蚕组织样品进行大规模蛋白质组学鉴定的方法

摘要

本发明涉及一种基于家蚕组织样品进行大规模蛋白质组学鉴定的方法，包括家蚕蛋白质组学样品前处理、分级肽段质谱上机检测和构建家蚕蛋白质数据库。通过优化蛋白提取方法，并采用高pH分级方法将肽段分8级，能尽可能多的提取到家蚕脂肪体样品，提升蛋白质鉴定数目；通过优化上样量和色谱梯度时间防止上样量过大造成样品喷针堵塞；通过优化色谱梯度时间缩短检测时间；建立了含有21878条蛋白质序列的Streamline数据库，该种数据库不仅能鉴定到更多的蛋白质数目，并且该数据库去除了冗余序列，有利于后期蛋白质组学数据分析。本发明建立了稳定、高效的家蚕蛋白质组学鉴定平台，对家蚕蛋白质组学大规模鉴定具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质组学领域，涉及一种基于家蚕组织样品进行大规模蛋白质组学鉴定的方法。

背景技术

近年来，高分辨率质谱仪的出现极大地推动了蛋白质组学的发展，家蚕蛋白质组学的研究也进入到了一个新的阶段。尽管如此，由于各研究采用的方法不同，很难对各研究结果进行关联和比较，各研究鉴定到的蛋白质数目和所阐释的科学问题也存在很大的差异，导致无法全方位地了解家蚕体内蛋白质在各时期和组织之间的表达情况。目前，拥有蛋白质全谱的动物仅有老鼠和人类，但是这两种物种都属于哺乳动物。家蚕属于鳞翅目昆虫，一生要经过卵、幼虫、蛹和蛾四个不同发育时期，是一种完全变态昆虫。对家蚕进行蛋白质组学全谱的鉴定能为我们认识昆虫乃至无脊椎动物的生长发育和各器官的生物学功能提供一个参考模板。因此，对家蚕进行大规模蛋白质组学鉴定具有重要的意义。

对家蚕进行大规模蛋白质组学鉴定，就需要有稳定、高效的蛋白质组学平台。目前，已经有一些采用超高分辨率质谱仪进行家蚕蛋白质组学鉴定的报道，这些研究虽然为家蚕蛋白组学研究打下基础，但鉴定到的蛋白质数目还有待提升，所用的方法不能用于家蚕组织样品进行大规模蛋白质组学鉴定。目前，一般提高蛋白质组学鉴定数目的方法多采用分级的方法，这些方法开发过程中多采用人类细胞系。有学者比较过不同分级技术的优缺点，选用的材料为海拉细胞系。而提高家蚕组织样品蛋白组学鉴定数目的方法还未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于家蚕组织样品进行大规模蛋白质组学鉴定的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于家蚕组织样品进行大规模蛋白质组学鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)家蚕蛋白质组学样品前处理：取家蚕脂肪体，加入100mM DTT/8M尿素溶液，样品放在冰上，利用G50组织研磨器对样品进行研磨，使样品充分溶解，离心收集上清液；上清液用FASP酶解方法对样品进行酶解，利用高pH分级方法将肽段分成8级，利用真空冷冻干燥仪将各组分冻干；

(2)分级肽段质谱上机检测：每级肽段分别加入50μL体积分数为0.1％的甲酸水将肽段溶解，上样量为8μL，有效色谱梯度时间为120min；

(3)家蚕蛋白质组学数据匹配数据库：利用90％阈值对NCBI、SilkDB、Silkworm和Uniprot 4个家蚕蛋白数据库进行去冗余处理，得到数据库Streamline，原始数据采用MaxQuant进行搜库。

优选的，步骤1)中，100mM DTT/8M尿素溶液加入量按每毫克家蚕脂肪体加入200μL100mM DTT/8M尿素溶液；研磨时间为3min；所述充分溶解为水平震荡器振荡5min；所述离心为12000g，25℃离心15min。

优选的，所述FASP酶解方法对样品进行酶解具体为：

1)将样品加入10kDa超滤管中，加入8M尿素溶液，混匀后置于离心机12000g，离心20min；

2)再加入8M尿素，12000g，离心20min；

3)重复步骤2)两次；

4)加入1M DTT，8M尿素溶液，管口用封口膜密封，置于37℃孵育2h；

5)撕开封口膜，加入1M碘乙酰胺溶液，混匀后，避光孵育1h；

6)12000g离心20min；

7)加入8M尿素溶液，混匀后12000g离心20min；

8)重复步骤7)两次；

9)加入50mM>4HCO₃溶液，12000g离心20min；

10)重复步骤9)三次；

11)将超滤管的外管更换成新外管，防止污染；

12)在超滤管中加入10μg/mL胰蛋白酶溶液，管口用封口膜密封，置于37℃恒温培养箱中孵育36h，将蛋白酶解成肽段；

13)撕掉封口膜，12000g离心20min；

14)在超滤管中加入40μL 50mM>4HCO₃溶液，12000g离心20min；

15)4℃冷冻浓缩至样品完全干燥。

优选的，所述利用高pH分级方法将肽段分成8级具体为：

1)从旋转柱底部取下白色塑料套，将旋转柱放在离心管中；

2)5000g离心2min，除去旋转柱中溶液；

3)取下旋转柱顶端红色帽子，将300μL乙腈加载到旋转柱中，盖上红色帽子后，再把旋转柱放到离心管中，置于离心机中5000g离心2min，清洗柱子并除去乙腈；

3)再用体积分数为0.1％的三氟乙酸洗旋转柱两次；

5)冻干的肽段样品中加入体积分数为0.1％的三氟乙酸溶液，涡旋30s以溶解肽段；

6)将旋转柱置于新的离心管中，将样品加载到柱中，盖上红色盖子后，置于离心机3000 g离心2min，离心管中即为流穿；

7)将旋转柱放到新的离心管中，加超纯水，3000g离心2min后即为洗涤液；

8)配置洗脱溶液如表1所示洗脱液，将旋转柱放到新离心管中，加入管号为1的洗脱液，盖上红色盖子后，3000g离心2min；

9)收集洗脱液于离心管中，打开红色帽子，向旋转柱中加入管号为2中的溶液300μL；重复8)、9)步骤，收集不同梯度洗脱液于8个离心管中。

优选的，分级肽段质谱上机检测具体为：

每个组分肽段分别加入体积分数为0.1％的甲酸水后振荡30s溶解，12000g离心10min；吸上清于上样瓶中，采用Thermo Fisher Scientific EASY-nLC 1000纳升级流速系统进行肽段的分离，平衡预柱的体积为10μL，流速为3.5μL/min，平衡分析柱的体积为5μL，流速为0.25 μL/min；上样量为8μL，吸样流速为8μL/min，使用3.5μL/min的流速将18μL0.1％甲酸水推入预柱和分析柱中，用梯度0.1％甲酸乙腈溶液进行肽段分离，流速为250nL/min；有效色谱梯度时间为120min梯度，用100μL体积分数为0.1％的甲酸乙腈清洗自动上样环；

采用Q Exactive质谱仪进行检测，检测时间为0-140min，喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃，离子模式为正离子模式，默认电荷为两个，全扫的分辨率为70000，AGCtarget 为1e6，Maximum IT为20ms，扫描范围为300到1800m/z，二级扫描分辨率为17500，AGC target为1e5，Maximum IT为60ms，采用Top 10原则采集数据，动态排除时间设置为30s；质谱环境温度为22℃，除湿机控制质谱工作环境空气湿度为50％。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种基于家蚕组织样品进行大规模蛋白质组学鉴定的方法，与传统的液氮研磨方法相比，具体如下优点：

1)采用G50组织研磨器在冰上对样品进行研磨，在不影响鉴定蛋白质数目的基础上，该种方式具有省时省力、安全、经济等优点；利用100mM DTT/8M尿素溶液对样品进行提取，能尽可能多的提取到家蚕脂肪体样品；

2)本发明采用8μL样品上样，能防止上样量过大造成样品喷针堵塞的情况。而现有技术中报道的家蚕蛋白质组学质谱检测时间多采用180min，本方法采用120min有效色谱梯度时间进行质谱上机检测，每针能减少60min的检测时间；

3)建立的家蚕Streamline数据库含有21878条蛋白质序列，该数据库不仅能鉴定到更多的蛋白质数目，并且该数据库去除了冗余序列，有利于后期蛋白质组学数据分析；

4)采用高pH级方法将肽段分8级，不仅能大大提升蛋白质组学鉴定数目，并且能大大减少检测时间，并且该种分级方法不用再经过脱盐过程，缩短了样品前处理时间。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为4种家蚕数据库整合去除冗余序列流程。

图2为不同研磨方法比较(A：蛋白质电泳图；B：鉴定到蛋白质的数目)。

图3为不同提取溶液鉴定到的蛋白质数目

图4为上样体积的影响(A：不同上样体积鉴定到的蛋白质数目；B：不同上样体积鉴定到的蛋白质的丰度)。

图5为时间梯度的影响(A：不同时间梯度鉴定到的蛋白质数目；B：不同时间梯度鉴定到的蛋白质的丰度)。

图6为肽段分级和蛋白分级比较结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、基于家蚕组织样品进行大规模蛋白质组学鉴定的方法

(1)家蚕脂肪体蛋白质组学样品前处理：

a.样品提取

1)取大约2mg家蚕脂肪体样品置于1.5mL离心管中，加入400μL 100mM DTT/8M尿素溶液，置于冰上，用卡尤迪G50组织研磨器研磨3min；

2)水平震荡器振荡5min，使样品充分溶解在溶液中；

3)12000g，25℃离心15min，取上清置于新的离心管中；

4)用Bradford蛋白质定量试剂盒检测样品蛋白质浓度。

b.样品前处理

1)吸取300μg样品加入到10kDa超滤管中，取8M尿素溶液补足至200μL，用移液枪吹吸数次混匀后，置于离心机12000g室温(18～25℃)离心20min；

2)再加入200μL 8M尿素，12000g室温(18～25℃)离心20min。

3)重复2)步骤两次，(超滤管外管底溶液接近超滤管内管管底时，将外管溶液倒出)；

4)加入4μL 1M DTT，150μL 8M尿素溶液，管口用封口膜密封，置于37℃孵育2h；

5)撕开封口膜，加入15μL 1M碘乙酰胺溶液，混匀后，室温(18～25℃)避光孵育1h；

6)12000g室温(18～25℃)离心20min；

7)加入200μL 8M尿素溶液，吹吸数次混匀后12000g室温(18～25℃)离心20min；

8)重复7)步骤两次；

9)加入200μL 50mM>4HCO₃溶液，12000g室温(18～25℃)离心20min；

10)重复9)步骤三次；

11)将超滤管的外管更换成新外管，防止污染；

12)在超滤管中加入400μL 10μg/mL胰蛋白酶溶液，管口用封口膜密封，置于37℃恒温培养箱中孵育36h，将蛋白酶解成肽段；

13)撕掉封口膜，12000g室温(18～25℃)离心20min；

14)在超滤管中加入40μL 50mM>4HCO₃溶液，室温(18～25℃)12000g离心20min；

15)4℃冷冻浓缩至样品完全干燥。

c.高pH旋转柱分级

1)从旋转柱底部取下白色塑料套，将旋转柱放在2.0mL离心管中；

2)5000g离心2min，除去旋转柱中溶液；

3)取下旋转柱顶端红色帽子，将300μL ACN加载到旋转柱中，盖上红色帽子后，再把旋转柱放到2.0mL离心管中，置于离心机中5000g离心2min，清洗柱子并除去CAN；

4)再用如3)中所述的方法用300μL 0.1％TFA洗旋转柱两次；

5)冻干的肽段样品中加入300μL 0.1％TFA溶液，涡旋30s以溶解肽段；

6)将旋转柱置于新的2.0mL离心管中，将300μL样品加载到柱中，盖上红色盖子后，置于离心机3000g离心2min，离心管中即为流穿；

7)将旋转柱放到新的2.0mL离心管中，加载300μL MilliQ水，3000g离心2min后即为洗涤液；

8)将乙腈和0.1％TFA按照表1配置洗脱溶液，将旋转柱放到新2.0mL离心管中，加载 300μL管号为1的洗脱液，盖上红色盖子后，3000g离心2min；

9)收集洗脱液于1.5mL离心管中，打开红色帽子，向旋转柱中加入2号管中的溶液300 μL；

10)重复8)、9)步骤，收集不同梯度洗脱液于8个1.5mL离心管中；

将离心管置于真空冷冻浓缩仪中抽干。

表1、高pH旋转柱分级中配置洗脱溶液的梯度

d.分级肽段质谱上机检测

每个组分肽段分别加入50μL 0.1％甲酸水后振荡30s溶解，室温12000g离心10min。吸上清12μL于上样瓶中。采用Thermo Fisher Scientific EASY-nLC 1000纳升级流速系统进行肽段的分离，平衡预柱的体积为10μL，流速为3.5μL/min，平衡分析柱的体积为5μL，流速为0.25μL/min。上样量为8μL，吸样流速为8μL/min，使用3.5μL/min的流速将18μL A相溶液(0.1％甲酸水)推入预柱(100μm×2cm，nanoViper，C18，5μm，)和分析柱(50 μm×15cm，nanoViper，C18，2μm，)中，用梯度B相溶液(0.1％甲酸乙腈)进行肽段分离，流速为250nL/min。有效色谱梯度时间为120min梯度。用100μL B相清洗自动上样环。

采用Q Exactive质谱仪进行检测，检测时间为0-140min，喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为275℃。离子模式为正离子模式，默认电荷为两个，全扫的分辨率为70000，AGCtarget 为1e6，Maximum IT为20ms，扫描范围为300到1800m/z，二级扫描分辨率为17500，AGC target为1e5，Maximum IT为60ms，采用Top 10原则采集数据，动态排除时间设置为30s。

质谱环境温度为22℃，除湿机控制质谱工作环境空气湿度为50％。

3、脂肪体蛋白质组学数据匹配

从表2的网站中下载家蚕蛋白质序列数据库。利用在线软件CD-HIT 90％阈值对NCBI (29619)、SilkDB(14623)、Silkworm(16329)和Uniprot(18319)4个数据库中的数据合并(75584)后进行去重复(33515)、去冗余(21878)，得到去除冗余的数据库Streamline (图1)。搜库参数如下：可变修饰选择Oxidation(M)和Acetyl(Protein N-term)，酶切位点选择Trypsin/P，最大漏切位点为两个，最大带电荷数为7，Protein FDR为0.01，最小肽段长度为6。

得到的数据去除污染序列数据和反向序列数据后，即得到原始蛋白质组学数据，共建定到3944种蛋白质(表3)。

表2、为家蚕数据库下载网址

表3、为利用大规模蛋白质组学鉴定方法鉴定到脂肪体中的蛋白质(iBAQ值排名靠前的前20个)

条件优化：

(1)研磨方式确定：

为寻找最佳的研磨方式，液氮提取与组织研磨器提取两种方法提取家蚕五龄三天的脂肪体蛋白质，蛋白电泳检测结果如图2所示。结果显示，两种研磨方式的蛋白数量相当，且组织研磨器提取蛋白数量微弱的增加。由于蚕的一些组织样品比较少，如果采用液氮研磨的方式提取蛋白，则会造成样品的损失。组织研磨器能在1.5mL离心管中研磨样品，蛋白质样品几乎不损失，但是在研磨过程中容易发热，会影响蛋白质的提取。通过比较可以看出，组织研磨器研磨样品虽然在研磨过程中会发热，但是鉴定的蛋白质数目并没有减少，反而有微弱的增加。造成这种情况的原因可能是由于蛋白质降解本身也不多，再加上质谱检测的原理是匹配特异肽段，虽然蛋白质降解，但是并不是完全降解为氨基酸。由于组织研磨器研磨并不会造成蛋白质数目的降低，所以在处理蛋白样品量比较小的情况下，可以采取组织研磨器研磨的方式进行样品进行研磨。这样可以避免蛋白质的损失，并且并不影响蛋白质的鉴定数目。

(2)提取试剂优化

分别使用常规的蛋白提取试剂4％SDS，4％SDS/100mM DTT，8M尿素，100mM DTT/8M尿素分别提取家蚕五龄三天脂肪体材料，使用FASP质谱前处理方式处理蛋白质样品，利用LC-MS/MS进行质谱检测，结果如图3所示。结果发现不同的提取试剂鉴定到的蛋白质数目是不同的，100mM DTT/8M尿素溶液鉴定到的蛋白质数目最多，鉴定到了1811种蛋白质。该结果还可以看出，SDS溶液的提取方法和尿素溶液的提取方法，鉴定到的蛋白质种类中绝大部分是一样的，不同的提取试剂又能提取到一些特有的蛋白质。因此使用本发明的提取试剂，提升了115种蛋白质。

(3)上样时间和上样体积优化

通过比较不同上样体积鉴定到的蛋白质数目，如图4可以看出，并不是上样体积越大鉴定到的蛋白质数目就越多。当达到某一饱和值时，鉴定到的蛋白质数目即不再增加。在上样量为6～8μg时最佳(8μL)。而此时，蛋白质的丰度也基本处于临界值，蛋白质丰度跟信号值的相应有关，因此信号值也处于临界值。每次检测梯度的时间也不是越长越好，对于家蚕样品，最佳梯度时间为2h(图5)，而此时蛋白的丰度值也是差不多。并且质谱上样过多的肽段不仅会跟分析柱无法结合而导致浪费，也容易造成分析柱堵塞，影响柱子和机器的使用寿命。由此可见，通过不同上样量的比较，我们可以发现可以提升322种蛋白质。通过不同梯度时间的比较，发现可以提升224种蛋白质。

(4)蛋白分级和肽段分级比较

通过比较蛋白分级、肽段分级与未分级鉴定到的蛋白质数目(图6)，可以看出，无论是蛋白分级，还是肽段分级，都能提升蛋白质的鉴定数目。肽段分级鉴定到的蛋白质数目比蛋白质分级鉴定到的蛋白质数目更多，并且肽段分级操作过程相对容易。综上所述，采用反向色谱柱分级是一种比较理想的分级方式。

其中蛋白分级具体方法如下：

同样选取五龄第三天脂肪体样品，用G50组织研磨器的方法研磨样品，提取试剂为8M 尿素100mM DTT溶液，选用Bradford定量试剂盒对蛋白质进行定量，将300μg蛋白加载到12％蛋白胶中进行电泳；拆下蛋白胶用考马斯亮蓝进行染色至整个胶面成深蓝色，再用脱色液将蛋白胶脱至无色。用Image scanner扫描仪将胶扫成电子档保存。用干净的手术刀将泳道根据蛋白丰度切成9份，分别置于1.5mL离心管中。

质谱前处理步骤：将分级后的蛋白质胶条用手术刀切成1立方毫米左右的立方体，装入干净的1.5mL离心管中；配置50％乙腈100mM>4HCO₃的浸洗溶液，向每个离心管中加入200μL浸洗液浸洗10min后，吸去洗液，重复此步骤两次；用真空冷冻浓缩仪将胶块抽干；用10mM>4HCO₃浸没小胶块，置于56℃金属浴中恒温温浴1h后吸去浸液；用55mM碘乙酰胺/50mM>4HCO₃浸没小胶块并于暗室孵育30min后吸去浸液；用200 μL 10mM>4HCO₃溶液浸洗10min后，吸去浸液。再用200μL乙腈溶液浸洗10min后，吸去浸液；重复此步骤一次；用真空冷冻浓缩仪将胶块抽干；向干燥的小胶块中加入10ng/μL 的胰蛋白酶溶液，待胶块完全膨胀后，除去多余的酶液；加入10mM>4HCO₃溶液覆盖小胶块；置于37℃恒温培养箱中过夜，将蛋白酶解成肽段；加入大约等体积的60％乙腈/5％甲酸溶液，超声振荡10min。瞬离后，收集上清于新的离心管中；重复此操作，将两次收集的上清用真空冷冻浓缩仪抽干。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。