人类γδT细胞识别应激分子—4型UL16结合蛋白的机制研究

摘要

UL16结合蛋白(UL16 Binding Proteins，ULBPs)是一个NK细胞活化型受体—NKG2D的配体家族，目前发现的同系物包括ULBP1～5。ULBPs可应激性表达在一些肿瘤细胞或病原体感染细胞的表面。ULBP1、2、和3之间存在55～60％同源性，而ULBP4序列则变化较大，且相关研究较少，仅限于ULBP4—NKG2D相互作用和活化NK细胞方面。 γδT细胞表面表达NKG2D，可识别MICA、ULBPs分子等配体分子。研究发现，γδT细胞表面的T细胞受体(TCR)γ和δ链异质二聚体分子也识别MICA。这种NKG2D和TCRγδ对相同配体分子双重识别的生物学意义尚不完全明了，据推测，可能与确保固有免疫细胞能及时清除表达应激分子的受损细胞有关的免疫监视功能有关。 本研究关注以下四个科学问题： 第一，回答TCRγδ是否识别ULBP4分子？这一问题至今尚无答案。事实上，ULBPs家族分子是否可与TCRγδ结合，至今无结构生物学的证据。由于ULBP4具有一定的基因表达的多样性，本研究推测机体可能会启动具有受体多样性的TCRγδ对其产生识别，故以ULBP4分子为靶分子，探讨TCRγδ对其识别的可能性。在这一问题框架下，要研究δ1链，或δ2链对其结合的特异性，并探究δ链中与配体结合起关键作用的部位—互补决定区(CDR)3的基因序列变化的特点。 第二，澄清ULBP4反应性γδT细胞的特性，如主要亚群，细胞因子分泌谱系和肿瘤细胞毒等。 第三，利用抗体阻断实验分析ULBP4—NKG2D和ULBP4-TCRγδ双重识别的生物学意义。 第四，通过ULBP4在EB病毒感染B淋巴细胞和肿瘤细胞表面的表达和ULBP4介导的γδT细胞细胞毒分析，来探究ULBP4在免疫监视(尤其是在细胞恶变早期)中的作用。 希望通过针对以上四个科学问题的科学研究可基本阐明γδT细胞对ULBP4识别的机制，并为系统阐释ULBP4的生物学意义提供有价值的资料。 为解决上述科学问题，本文进行了以下研究： (1)利用293ET真核表达系统表达了人ULBP4分子胞外区(1～226氨基酸)的重组蛋白ULBP41—226；利用pcDNA真核表达载体系统在EL4细胞中稳定表达全长的ULBP4基因，这些系统的建立为后续的研究奠定了基础。 (2)首次使用固相化ULBP4分子诱导OEC和CC中的肿瘤浸润γδT淋巴细胞的体外扩增，获得纯度为80％的Vδ2T细胞，并开展ULBP4反应性γδT细胞TCRVδ—CDR3区的结构生物学研究。 (3)利用配体受体酶联免疫结合实验、流式细胞术和γδTCR基因转染的TCR-β链缺陷型的T细胞系J．RT3-T3.5细胞平台证实，ULBP4与TCRγ9δ2特异结合。 (4)ELISA法检测ULBP4刺激γδT细胞产生细胞因子的谱系。MTT方法检测γδT细胞对表达ULBP4的肿瘤细胞的杀伤活性。 (5)在抗体封闭实验中，分别分析了anti—NKG2D、anti-TCRγδ、anti—NKG2D+anti-TCRγδ单抗封闭前后，ULBP4活化的γδT细胞分泌IFN—γ水平及对ULBP4阳性的肿瘤细胞细胞毒的变化。实验结果显示，anti—NKG2D+anti—γδTCR单抗联合阻断的效果强于anti—γδTCR或anti—NKG2D单独阻断作用。 (6)结合流式细胞术和组织化学方法，检测ULBP4在不同来源肿瘤细胞、组织和EB病毒转化前后B淋巴细胞表面的表达。分析ULBP4介导的γδT细胞细胞毒效应。 综上，γδT细胞可凭借表面的NKG2D和TCRγδ结合并识别与肿瘤和感染相关的应激分子ULBP4，其自身发生细胞活化，对肿瘤细胞，恶变细胞，病毒感染细胞迅速产生细胞毒效应，体现了固有免疫系统在免疫监视中所发挥的直接与迅捷的特点。以ULBP4为靶的免疫诊断与治疗策略可能为肿瘤的早期诊断与干预提供新型手段。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

前 言

实验材料

实验方法

实验结果

一、ULBP4克隆构建、表达、纯化和鉴定

(一)重组ULBP41-226蛋白在E.coli中的表达与纯化

(二)重组ULBP41-226在真核细胞中的表达、纯化与鉴定

(三)含ULBP4全长基因的重组真核表达载体稳定转染EL4细胞

(四)固相化ULBP4可在体外诱导以Vδ2型为主的TIL增殖

(五)ULBP41-226反应性γδTIL细胞受体δ链CDR3基因片段序列分析

(六)ULBP4可与γδT细胞受体特异性结合

(七)分析ULBP4反应性γδT细胞的特性

(八)ULBP4可被γδT细胞表面的NKG2D和TCRγδ双重识别

(九)探讨ULBP4表达与机体抗肿瘤和抗感染免疫监视的关系

讨 论

结论

参考文献

综述：ULBPs研究进展

致 谢

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