人类致病相关毛孢子菌表型和种系发生特征及种间鉴定方法的比较研究

摘要

多年以来，毛孢子菌仅做为皮肤浅部感染的毛结节菌病的病原体而为人们所了解。近年，随着免疫缺陷人群的不断扩大，以阿萨希毛孢子菌为代表的毛孢子菌属各菌种引起人类侵袭性感染的比例不断增加。由于毛孢子菌属多年来分类的简化以及生化鉴定资料的缺乏，该菌属准确的种间鉴定和不同菌种致病力及耐药性的差异等问题一直是困扰临床医生和医学真菌研究者的难题。准确的种间鉴定对准确把握该菌属不同菌种引起的真菌感染性疾病的流行病学、易感部位、临床表现及治疗等方面具有重要意义。本文从1例阴道定植的墨汁毛孢子菌的分离鉴定开始，围绕毛孢子菌属中部分与人类致病相关菌种的表型特征、分子进化特征、各种种间鉴定方法在毛孢子菌属鉴定中的作用等方面进行了较为系统的比较研究。文章分为五个部分： 第一部分：报告1例墨汁毛孢子菌的阴道定植病例并对该菌进行分离鉴定和临床实验研究。患者女，34岁，阴道分泌物增多伴异味2个月就诊。临床实验室检查可见乳白色均质化分泌物附着于阴道壁黏膜，阴道分泌物Nugent评分5～6分。先后2次阴道分泌物培养均分离出淡黄色有皱褶的酵母样菌落。该菌在42℃可生长，玻片玉米琼脂小培养见菌丝顶端附着胞形成及典型八叠球菌样结构，最佳生长培养基为酵母菌形态琼脂培养基(YMA)，脲酶试验阳性，API20C AUX和分子测序鉴定证实为墨汁毛孢子菌(Trichosporon inkin)；该菌对两性霉素B和克霉唑、氟康唑等唑类药物敏感，对氟胞嘧啶和卡泊芬净耐药。这是国内首次发现毛孢子菌在阴道内的定植，其准确鉴定有赖于表型特征、生化反应及分子测序的综合分析。 第二部分：对不同标本来源的墨汁毛孢子菌分别采用rRNA基因内转录间隔区(ITS)和基因转录间隔区(IGS1)测序，ITS和IGS1区PCR限制性片段长度多态性分析(PCR—RFLP)和基因组DNA的随机扩增多态性DNA(RAPD)等方法，进行墨汁毛孢子菌分子特征及种内分型研究。结果显示，不同标本来源的rDNA—ITS和IGS1的序列相似性均高达100％，RFLP酶切图谱具有较高的种内一致性；不同菌株的RAPD图谱不尽相同。研究表明：rDNA—IGS1区测序及RFLP多酶切较适合于墨汁毛孢子菌的菌种分子鉴定，而基因组DNA的RAPD则更适合于菌种的种内分型。 第三部分：对临床收集到的阿萨希毛孢子菌、星形毛孢子菌、皮样毛孢子菌、墨汁毛孢子菌、真皮毛孢子菌、T．domesticum、T．jirovecii和T．debeurmannianum等8种14株毛孢子菌进行最适培养基生长试验、单菌落体视显微镜形态观察、玉米琼脂玻片小培养、温度耐受试验、脲酶试验、放线菌酮耐受试验、生化鉴定和体外药敏试验等生物学、形态学、生理生化等表型特征的比较，探索不同毛孢子菌表型上的种间差异性。结果显示，不同毛孢子菌的大体菌落形态差异不明显，但单菌落形态各具特征；玻片小培养部分菌种可见附着胞、巨孢子和八叠球菌等特征性结构，菌丝构型及出芽方式也有助于种间鉴别；不同菌种温度耐受试验和放线菌酮耐受试验存在一定的差异，但不足以区别所有的菌种，墨汁毛孢子菌的温度耐受性最高，真皮毛孢子菌和星形毛孢子菌的放线菌酮耐受性最强；阿萨希毛孢子菌和墨汁毛孢子菌的生化鉴定准确率均达100％，但可靠性仅为80％和66.7％，其他菌种均无法实现生化方法的准确鉴定；所有的毛孢子菌均对5—氟胞嘧啶和卡泊芬净耐药，大多数阿萨希毛孢子菌株对两性霉素B、氟康唑和伊曲康唑耐药但对伏立康唑敏感，真皮毛孢子菌则对所有的唑类药物耐药而对两性霉素B敏感。研究表明，体视显微镜下单菌落形态观察有助于毛孢子菌表型的种间鉴定，生化鉴定仅能对少数毛孢子菌实现准确鉴定，不同种的毛孢子菌对抗真菌药物的敏感性存在较大差异，准确的种间鉴定和体外药敏试验对毛孢子菌深部感染的临床药物选择具有重要意义。 第四部分：通过rDNA—ITS和IGS1测序及种系进化分析，对8株14株毛孢子菌进行分子生物学鉴定和种系进化研究，并对中国来源的阿萨希毛孢子菌进行基因型分类，对日本毛孢子菌和星形毛孢子菌的种系发生关系进行比较研究。结果显示，rDNA—ITS和IGS1测序能够较准确地实现14株毛孢子菌的分子种间鉴定，rDNA—ITS为基础的种系发生树能准确区分日本毛孢子菌和星形毛孢子菌以外的其他人类致病相关的毛孢子菌，而rDNA—IGS1的种系发生树能准确区分所有人类致病相关毛孢子菌的差异。中国来源的阿萨希毛孢子菌多属于基因型Ⅰ和Ⅳ，首次发现以往从未报告的基因型Ⅶ。而日本毛孢子菌和星形毛孢子菌的鉴定目前存在很多混乱，研究中的星形毛孢子菌临床株可能是介于日本毛孢子菌和星形毛孢子菌间的新种或新的变种。 第五部分：采用rDNA—ITS—RFLP和rDNA—IGS1—RFLP多酶切技术构建8种14株毛孢子菌的酶切谱系并进行聚类分析，尝试将该方法用于人类致病相关毛孢子菌的快速种间鉴定。结果显示，rDNA—ITS—RFLP多酶切可有效地将8种毛孢子菌分为不同进化分枝的4个亚群，而rDNA—IGS1—RFLP多酶切则可实现8种14株毛孢子菌准确的种间鉴定，并实现对部分进化距离较远的阿萨希毛孢子菌基因型之间的区分。研究显示，在毛孢子菌种间分子鉴定方面，rDNA—ITS—RFLP和rDNA—IGS1—RFLP多酶切技术以其准确、快速、简便、低成本等特点显示出良好的应用前景，有望用于临床常规实验室毛孢子菌种水平的快速鉴定。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分阴道定植墨汁毛孢子菌的分离鉴定

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分墨汁毛孢子菌的分子鉴定和种内分型研究

材料与方法

结果

讨论

参考义献

第三部分人类致病相关毛孢子菌的表型特征研究

材料与方法

结果

1.菌落大体形态研究

2.玻片小培养

3.温度试验

4.脲酶试验

5.放线菌酮耐受实验

6.生化鉴定

7.体外药敏试验

讨论

参考文献

第四部分人类致病相关毛孢子菌种系发生、分类与种间鉴定

材料与方法

结果

讨论

参考义献

第五部分rDNA-RFLP多酶切技术用于人类致病相关毛孢子菌种间鉴定初探

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述：毛孢子菌与毛孢子菌相关疾病

在读期间发表论文及参加学术活动情况

致谢