临床相关毛孢子菌体外药物敏感性及分子生物学鉴定方法研究

摘要

[目的]探讨临床相关毛孢子菌对5种常见抗真菌药物的体外敏感性；研究联合应用PCR—反向线点杂交技术鉴定临床常见毛孢子菌。 [方法]首先对48株毛孢子菌通过形态学、API20C AUX、Vitek2 Compact进行初步鉴定，然后测序核糖体rDNA ITS、28S D1—D2区准确鉴定到种；对36株阿萨希毛孢子菌核糖体rDNA28S和5S之间的IGS1区进行测序并基因分型，作分子流行病学分析；采用浓度梯度法(E-Test)测定氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B及卡泊芬净对48株毛孢子菌的最低抑菌浓度(MIC)；基于不同种毛孢子菌rDNA ITS或D1—D2区序列多形性设计种特异性探针，评价反向线点杂交技术对常见毛孢子菌的区分能力。 [结果]形态学方法不能准确区分不同种的毛孢子菌，生化鉴定法，如API20C AUX或Vitek2 Compact只能鉴定阿萨希毛孢子菌、粘质毛孢子菌及皮瘤毛孢子菌，对这3种之外的其他毛孢子菌无法鉴定。联合应用核糖体rDNA ITS及D1—D2区序列分析将48株毛孢子菌鉴定为8个种：36株阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)、1株皮瘤毛孢子菌(T．inkin)、1株真皮毛孢子菌(T．dermatis)、1株皮肤毛孢子菌(T．cutaneum)、1株赖巴克毛孢子菌(T．laibachii)、2株T．japonicum、4株T． domesticum和2株T．jirovecii。IGS1区序列分析结果显示35株阿萨希毛孢子菌(菌株PUMCH30418没参加分析)共有四种基因型，分别为genotype1，3，4，6，所占比例分别为28.6％、20％、48.5％、2.9％；报道称日本菌株主要为genotype1，美国菌株为genotype3或5。体外药敏结果显示：氟康唑和两性霉素B对阿萨希毛孢子菌活性很差：MIC50分别为24μg/mL和2μg/mL，MIC90分别为256μg/mL和64μg/mL；除一株真皮毛孢子菌(T．dermatis)对伏立康唑有较高MIC值外，伏立康唑和伊曲康唑对不同种毛孢子菌有很好的体外活性；新型抗真菌药卡泊芬净对毛孢子菌几乎无体外活性，除一株皮肤毛孢子菌(T．cutaneum)外，其他47株毛孢子菌MIC>32μg/mL。反向线点杂交的结果：通过对8种毛孢子菌核糖体rDNA ITS及D1—D2区序列多形性分析，共设计了34个种特异性探针；所有探针具有相同的参数，长度18—30bp，Tm值58—65℃，二级结构不超过中级，不形成二聚体等；从DNA提取到反向线点杂交结果观察历时10多个小时，以测序鉴定结果为标准，反向线点杂交技术成功地将8种毛孢子菌区分开来。 [结论]形态学方法不论是菌落形态还是显微镜下特点都不足以区分不同种的毛孢子菌；生化鉴定法常常对少见真菌无能为力，本研究中API20C AUX或Vitek2Compact只能鉴定阿萨希毛孢子菌、粘质毛孢子菌及皮瘤毛孢子菌；DNA序列分析，特别是联合核糖体rDNA ITS及D1—D2区序列分析可快速准确地区分不同种毛孢子菌；反向线点杂交技术基于rDNA ITS及D1—D2区序列多形性设计种特异性探针，经简单的反向线点杂交步骤成功地将8种毛孢子菌鉴定开来，是一种耗时短、操作简便、特异性良好的分子生物学鉴定及诊断方法；毛孢子菌对5种常见抗真菌药物的敏感性不同于常见酵母菌，且不同种毛孢子菌之间的敏感性也有很大差异。本研究与文献中的结论相同，两性霉素B和氟康唑对阿萨希毛孢子菌的体外活性较差，卡泊芬净对毛孢子菌没有体外抗菌活性；三唑类抗真菌药物伏立康唑和伊曲康唑对毛孢子菌的体外敏感性最好。 所以对临床分离得到的毛孢子菌准确鉴定到种并进行体外药敏试验对指导临床采取合理的治疗措施具有非常重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分菌株收集、鉴定及分子流行病学研究

第二部分对常见抗真菌药物体外敏感性研究

第三部分反向线点杂交技术鉴定临床常见毛孢子菌

全文结论

文献综述 毛孢子菌感染的研究现状

参考文献

研究生期间发表及待发表的论文列表

附录

个人简历

致谢