纳米材料PAMAM毒性机理研究和H5N1型禽流感病毒致急性呼吸损伤机理研究

摘要

纳米材料与常规物质具有完全不同的物理化学效应。纳米材料由于具有极小的半径，而存在特殊的小尺寸效应、量子效应和巨大比表面积。树枝状大分子是一种新型的合成高分子纳米材料，在药物传递、医学成像和临床诊断方面有着重要意义。
　　 聚酰胺树枝状大分子纳米材料(PAMAMdendrimer)是一种具有高度分支化、对称、呈辐射状的大分子。它由中心核、内层重复的分支亚单位以及表面的功能基团组成。整代的PAMAM纳米材料表面的功能基团为氨基，半代的PAMAM纳米材料表面的功能基团为羧基。整代的树枝状大分子PAMAM表面存在高密度的氨基，可与DNA等生物大分子结合并在空间上高度压缩，作为非病毒型载体将DNA和寡核苷酸等遗传性物质或者治疗药物高效输送到细胞中。树枝状大分子本身也被用作研究药物，用于消除感染，抑制细胞、病毒、细菌、蛋白间的多价结合等。可见，纳米材料在医学领域具有极大的应用前景。
　　 但是，我们同时也观察到，易于进入各种细胞是树枝状大分子区别于其他合成材料载体的独特优势，也是其具有潜在风险的原因。因此，树枝状大分子的细胞相容性受到研究人员的格外关注。国外的研究人员研究了第3、5、7代PAMAM的体内外毒性、免疫原性及生物分布，结果显示粒子尺寸对其细胞毒性有明显的影响。但目前各项研究正处于起步阶段，还需要进行大量的后续研究。
　　 在本研究中，通过前期的细胞实验，我们验证了PAMAMG3、G5、G7等的细胞毒性。并重点对G5进行了进一步的研究。将纳米材料PAMAMG5注入小鼠体内后取各脏器组织进行病理学检查发现，纳米材料PAMAMG5主要对肺脏和肝脏产生损伤，我们分别对其作用机理进行了详细的研究。
　　 由于PAMAMG5可以导致小鼠快速死亡，我们首先研究了G5导致肺损伤的作用机理。通过筛查研究发现纳米材料PAMAMG5可以使血管紧张素2(AngiotensinⅡ)水平大大上升，血管紧张素转化酶2(ACE2)表达下降，从而导致肾素血管紧张素调节系统紊乱，导致肺动脉高压形成肺水肿，造成了急性肺损伤。我们进一步利用ACE2基因敲除小鼠进行验证，明确了PAMAMG5导致急性肺损伤的主要作用机制是通过下调ACE2的表达水平，改变其负调节作用，导致AngiotensinⅡ水平上升，过量的AngiotensinⅡ在肺组织中结合其受体，形成肺动脉高压，最终导致急性肺损伤。
　　 我们又对纳米材料PAMAMG5导致的肝损伤进行了进一步的研究发现，纳米材料PAMAMG5可以导致急性肝损伤。研究结果表明，纳米材料PAMAMG5可以激活血液中单核细胞的TLR4受体，可以激活NF-κB转基因小鼠肝脏的相应信号通路，并且导致血液中多种炎性因子的水平升高。对注射纳米材料PAMAMG5的小鼠肝功能进行检测发现，小鼠血液中的转氨酶水平升高，凝血时间延长，血液总蛋白含量下降，肝重体重比升高。因此，我们认为纳米材料PAMAMG5的作用机制可能是通过激活肝脏中Kupfer细胞（巨噬细胞）的TLR4，从而激活TLR4-NF-κB信号通路，致使各种炎性因子水平升高，最终导致肝组织发生急性炎症，造成急性肝损伤。
　　 H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤机理的研究
　　 不断发生H5N1型高致病性禽流感病毒感染禽类和人类的事件已经引起了世人的广泛关注。由于这种病毒在禽类中传播迅速，可以导致禽类的大范围死亡。虽然尚未突破人与人之间的传播障碍，但病人的病死率非常高。且该病毒具有极高的变异性，极有可能爆发大规模的流行。目前还没有有效的预防与治疗方法。因此，H5N1型禽流感病毒致病机理的研究显得尤为重要。
　　 急性肺损伤导致的急性呼吸窘迫综合征是病人死亡的主要原因[2-3]，但H5N1型禽流感病毒引起急性肺损伤的具体分子机理尚不清楚。在多种病毒与细胞自噬存在相互作用的提示下，我们首先验证了H5N1型禽流感病毒可以导致细胞发生自噬，接下来从细胞和整体水平上对H5N1型禽流感病毒导致的急性肺损伤进行了研究，验证了细胞自噬性死亡可以导致急性肺损伤的发生。我们的研究结果证明，H5N1型禽流感病毒可以通过Akt-TSC2-mTOR信号通路诱导肺上皮细胞发生自噬，并导致细胞自噬性死亡，该病毒还可以导致以肺组织湿干比升高，肺弹性升高，肺组织病理学改变等为表现的急性肺损伤的发生。我们的研究结果还表明自噬的特异抑制剂及自噬相关特异分子的敲除可以缓解H5N1导致的急性肺损伤。因此，H5N1型禽流感病毒的致病机理为通过Akt-TSC2-mTOR信号通路诱导肺上皮细胞发生自噬性死亡，并最终导致急性肺损伤的发生。此结果的阐明为了解H5N1型禽流感病毒致病机理及研发新型抗病毒药物提供了重要的理论基础。