罗汉果转录组、表达谱的高通量测序及甜苷V生物合成关键酶的克隆

摘要

罗汉果Siraitiagrosvenorii(Swingle)C．Jeffrey是我国特有珍贵药用和甜料植物，为葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)多年生藤本植物，具有止咳祛痰、凉血舒胃、润肠通便等作用。其主要成分甜苷V是世界上最强的非糖甜味物质之一，为蔗糖甜度的300-400倍，是一种低热量、纯天然的甜味剂及理想的保健品，此外还有抗氧化、免疫调节、抗癌、降血糖等作用。甜苷V目前还不能化学合成，主要依靠提取获得。罗汉果对生境要求苛刻，只适宜在广西生长，且栽培中不能连作，果实中甜苷V含量低，无法满足市场需求，因此亟待探索提高甜苷V含量的新途径、新方法。本论文利用高通量测序技术对罗汉果果实的转录组和表达谱进行了研究，从分子水平阐释罗汉果甜苷V生物合成的分子机理，大规模寻找罗汉果功能基因，并在此基础上克隆了甜苷V生物合成相关基因的全长。主要研究结果如下：
　　 1．罗汉果授粉后30天到50天之间主要以苦味成分苷ⅡE为主，70天时含量急剧下降，检测不到苷ⅡE。苷Ⅲ只在50天果实中出现。苷V含量在50天之前含量低，在50天至70天之间急剧增长了25.9倍，至85天增长到最高含量。葡萄糖含量在30天和50天变化不明显，而70天下降了3.24倍。葡萄糖含量与苷ⅡE、苷V含量的变化存在一定的消长关系。
　　 2．应用Solexa高通量测序技术对罗汉果果实进行转录组测序，得到3.41G的原始数据，通过拼接得到43891条Unigenes。与次生代谢相关的unigenes有739条，其中涉及萜类骨架合成的Unigenes有60条。利用转录组数据发现了罗汉果甜苷V生物合成通路中几乎所有的基因，涉及到20种基因。另外还得到了80条P450基因Unigenes、72条glycosyltransferase基因的Unigenes和90条glucosyltransferase基因的Unigenes。这些Unigenes是今后对罗汉果三萜皂苷生物合成进行全面调控的重要基因资源。
　　 3．在3d、50d、70d表达谱中均得到了300万条以上Cleantags，去冗余后得到85000条以上不同种类的Tags。通过分析发现占mRNA总量近73-76％的是种类不到5.1-5.9％的少数mRNA，而占种类56-59％的mRNA全部加起来不到mRNA总量的3.9-4.1％。对差异基因进行统计发现在3d/50d中，有2119个基因上调，2642个基因下调；3d/70d中，2150个基因上调，2797个基因下调；50d/70d中，1078个基因上调，1422个基因下调。
　　 4．利用表达谱对罗汉果甜苷V生物合成途径涉及的20种基因在各个时期的表达水平进行分析发现除AACT、MVD、CMK、HDS、SQS基因表达量在3个时期中未见明显变化外，其余16个基因都有各自的变化规律。授粉后3天到50天之间，DXS、DXR、MCS、IDS下调，其余12种基因均上调。50天到70天之间，HMGR、MCS、IDS、IPP、GPS、FPS、CAS下调外，其余9种个基因均上调。从3天幼果到70天接近成熟果实，各个基因表达的总体趋势是：除DXR、MCS、IDS、IPP-Ⅰ表现下调外，HMGS、HMGR、MK、PMK、MCT、IPI-Ⅱ、GPS、FPS、SQS、CAS和CS基因均上调。其中SQE和CS变化最大，70天比3d的表达量分别提高了8.89倍和9.69倍。
　　 5．通过对80条CytochromeP450Unigenes和90条glucosyltransferaseUnigenes基因表达水平变化规律进行研究，推测Unigene23541、Unigene24189、Unigene26598和Unigene43109等4条候选的P450基因和Unigene4016、Unigene8672、Unigene13633、Unigene15400、Unigene35056和Unigene38974等6条候选的UDPG基因可能参与甜苷V骨架生物合成。
　　 5．利用RACE技术首次克隆了14条罗汉果甜苷V生物合成相关的基因全长和4条5’或3’片段。其中MVA途径有6条：AACT、HMGS、HMGR、MK、PMK、MVD;共同代谢途径中IPI、GPS、FPS、SQS、CAS、CS等6条，以及SQE5’端；MEP途径中MCT和IDS基因的全长、DXS和HDS的5’端以及MCS的3’端。此外还得到了2条糖基转移酶的全长。并对所有全长基因进行了序列分析，它们均为首次从罗汉果中报道的全长或部分片段序列。
　　 本论文首次利用Solexa高通量测序技术对罗汉果果实的转录组及不同时期的表达谱进行分析，得到了大量的罗汉果基因信息，并克隆了涉及罗汉果甜苷V生物合成相关的基因全长。这为罗汉果功能基因组学以及甜苷V生物合成分子机理研究打下了坚实的基础。

目录

前言

第一章 罗汉果研究进展

1 罗汉果生药学的研究

1.1 生物学特性

1.2 罗汉果名称的由来

1.3 种质资源的收集及利用

2 罗汉果化学成分的研究

2.1 葫芦烷三萜苷类

2.2 蛋白质、氨基酸类

2.3 黄酮类

2.4 甘露醇

2.5 单糖及多糖类

2.5 脂肪酸类

2.6 其他成分

3 罗汉果药理方面的研究

3.1 止咳祛痰作用

3.2 免疫作用

3.3 降血糖作用

3.4 抗癌作用

3.5 抗氧化活性作用

3.6 毒性

3.7 对肠胃的影响

4 罗汉果组织培养及分子生物学方面的研究

5 罗汉果苷生物合成途径的探讨

5.1 三萜皂苷生物合成途径

5.2 三萜皂苷生物合成途径中的关键酶

5.3 罗汉果苷生物合成途径的推测

6 展望

参考文献

第二章 罗汉果不同时期果实内含物变化规律

一 引言

1 罗汉果苷类研究

2 葡萄糖在罗汉果苷从低糖苷向高糖苷转化中起关键作用

3 本研究的目的和意义

4 研究内容

二 材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

三 结果与分析

1 罗汉果苷类标准品保留时间

2 苷类成分含量

3 糖类成分含量

四 讨论

1 罗汉果苷类的变化规律

2 糖类成分变化规律

五 结论

参考文献

第三章 利用高通量测序技术研究罗汉果果实的转录组及表达谱

一 引言

1 差异表达基因研究方法

2 研究的目的和意义

3 研究的内容

二 材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

三 结果与分析

1 RNA提取

2 转录组测序

3 表达谱测序

四 讨论

1 RNA提取方法的选择

2 高通量测序技术在基因挖掘中的作用

3 罗汉果生物合成途径相关酶的挖掘

4 转录组和表达谱的结合为基因克隆提供了新的思路

五 结论

参考文献

第四章 罗汉果苷生物合成关键酶的RACE克隆及分析

一 引言

1 全长eDNA克隆的策略

2 RACE技术

3 研究的目的和意义

4 研究的内容

二 材料与方法

1 材料与方法

2 实验方法

三 结果与分析

1 罗汉果苷生物合成途径中相关基因全长克隆

2 罗汉果苷生物合成相关基因功能分析

3 糖基转移酶

四 讨论

1 高通量测序技术组装的可信度

2 RACE过程中的问题及经验

3 糖基转移酶在罗汉果苷代谢中的作用

五 结论

参考文献

附录

致谢

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