三倍体罗汉果转录组表达谱分析及甜苷V生物合成中4个关键酶基因的功能研究

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：
　　第一部分：三倍体无籽罗汉果与二倍体罗汉果的转录组及表达谱差异分析。
　　无籽罗汉果果实具有明显的商业优势，因为种子中含有的油类物质影响果实中有效成分的提取。利用杂交的手段，以二倍体作为母本雄性不育的四倍体作为父本，已经成功获得了三倍体无籽罗汉果。为了阐明正常二倍体和三倍体这两种倍性的罗汉果果实在分子方面的差异，采用转录组测序和表达谱分析来分析二者的差异。
　　以两种倍性果实结合产生一个综合的cDNA文库，总共得到了26.4 M的转录本reads，其平均长度为90 bp。经过逐级组装，最终获得了64，732条与果实和种子形状相关的Unigene。我们从中发现329个基因是二倍体果实所特有的，330个基因是三倍体果实所特有。相对于二倍体果实中基因的表达，在三倍体果实中有1，748个基因显著上调，2，037个基因显著下调。功能分析结果显示，41，678条Unigene得以功能注释，剩余的22，694条Unigene是罗汉果中潜在的新基因。KEGG分析结果显示，总共将17，593条Unigene注释到了119个代谢途径中，其中118个代谢途径中都有差异表达的基因。值得一提的是，油菜素内酯合成途径上调，然而赤霉素合成途径、三羧酸循环、糖酵解、脂肪酸代谢及氮代谢都下调。有趣的是，一个编码T-细胞质雄性不育恢复因子的基因，2个注释为STP合酶的基因以及2个参与雄性减数分裂的基因都显著下调，这几个基因有可能与雄性不育有关。另外我们还发现了五类候选基因可能与胚败育有关。赤霉素和玉米素含量与参与其合成的基因的表达一致。
　　关于二倍体和三倍体罗汉果果实，虽然有诸多方面的差异，如果实大小，有无种子，激素含量高低以及差异表达的基因。这些结果都深化了我们对三倍体果实和种子形成的理解，对将来无籽罗汉果及其他植物的无籽育种提供理论基础。
　　第二部分：罗汉果甜苷V生物合成中的4个关键酶基因的功能研究。
　　罗汉果Siraitia grosvenorii是重要的传统中药，同时又作为甜料作物具有巨大的发展潜力。罗汉果苷V（morgroside V）作为罗汉果重要的活性成分和甜料成分，甜度奇高，而且具有良好的止咳祛痰等功效。由于甜度高、热量低、无毒、口感佳等优势，罗汉果甜苷V具有广阔的发展前景，但是罗汉果甜苷V含量低、生产成本高的难题制约了其发展。而葫芦二烯醇作为罗汉果苷合成过程中的前体物质，其合成过程中的酶的表达与活性调控着终产物甜苷V的含量，其中位于上游的HMGR是MVA途径的第一个限速酶，制约着甲羟戊酸的合成;SQS是合成角鲨烯的关键酶;CS是直接催化生成葫芦二烯醇的关键酶，直接影响其含量;而CAS与CS催化共同的底物2，3-氧化角鲨烯，形成不同的分支，间接影响罗汉果苷的形成。研究罗汉果苷生物合成途径中的相关酶功能，将有助于理解罗汉果苷的生物合成机制，为调控罗汉果苷的合成奠定基础，并将为罗汉果转基因育种提供科学依据，为将来基因工程提供重要的靶基因。本研究从已有的转录组数据中找到相关酶的unigene序列，从克隆基因全长入手，对SgHMGR、SgSQS、SgCS和SgCAS这4个基因从基因全长克隆、生物信息学分析、实时荧光定量方法分析时空表达模式、异源表达、亚细胞定位等几个方面展开研究。主要研究结果如下:
　　1)SgCS基因的全长克隆，获得了2280bp长的SgCS-ORF，经生物信息学软件预测，SgCS编码的蛋白不含跨膜区，不含信号肽，与西葫芦和黄瓜中的CS蛋白同源性最高。SgCS基因在不同时期的果实中表达情况显示，在50天内出现了2个高峰期，分别为10天和0天。30天-50天的表达丰度非常低，50天几乎不表达。SgCS基因能够在原核系统中得以表达，但是以包涵体的形式存在没有活性。构建酵母表达载体，转化酵母经诱导后，能够利用酵母自身的2，3-氧化角鲨烯催化合成葫芦二烯醇，证明SgCS具有葫芦二烯醇合酶的功能。构建植物过表达载体SgCS-pBI121，通过农杆菌介导转化拟南芥，经PCR鉴定得到目的条带，实时荧光定量OCR检测SgCS基因在转基因拟南芥中表达上调。构建SgCS基因的亚细胞定位载体SgCS-pC-YFP，注射法转化烟草下表皮细胞，观察荧光结果定位于细胞核和细胞质中，与软件预测结果一致。
　　2)用RACE-PCR的方法获得了SgCAS基因的5'和3'RACE，拼接序列并通过PCR扩增得到2298 bp长的SgCAS-ORF，生物信息学软件预测SgCAS编码的蛋白不含跨膜区，不含信号肽，很可能定位于叶绿体和细胞核中，与丝瓜和西葫芦中的CAS同源性最高，其次是黄瓜。SgCAS基因在不同时期的果实中表达情况显示，在15天时达到最高，5天的表达量最低。SgCAS基因能够在原核表达系统pET28a/BL21(DE3)中得以表达，但是以没有活性的包涵体形式存在于细胞中，进而选择在酵母表达系统pYES2/IVF中验证其功能，发现SgCAS能够催化产生环阿乔醇，具有角鲨烯环化酶的功能。进一步构建植物干扰载体SgCAS-pBIRNAi侵染烟草，抗性及PCR筛选得到阳性转基因烟草，经实时荧光定量PCR检测到SgCAS基因在转基因烟草中表达下调。为了验证亚细胞定位的预测结果，我们构建了SgCAS-pC-YFP的亚细胞定位载体，注射转化烟草，发现荧光信号出现在细胞核和细胞质中。
　　3)RACE技术及序列拼接获得了SgSQS-ORF片段，长1254bp，经预测，该基因编码的蛋白亦不含跨膜区、不含信号肽，很可能定位于细胞骨架和细胞质中。实时荧光定量技术检测SgSQS在授粉后50天的表达规律，结果发现在10天和20天出现了2个高峰期，50天的含量最低。构建原核表达载体转化大肠杆菌，经诱导表达、SDS-PAGE及Western blot鉴定，发现SgSQS可以在大肠杆菌中表达，但是以包涵体的形式存在，不具有生物学活性。构建亚细胞定位SgSQS-pN-YFP转化烟草下表皮细胞，观察到该蛋白位于细胞质、细胞核和细胞质膜上，与预测结果较为一致，由于缺乏细胞骨架的Marker无法确定是否定位于细胞骨架上。此外，还构建了1个植物过表达载体和2个植物干扰载体。
　　4)通过RACE-PCR的手段获得了SgHMGR的5'RACE和3'RACE，经过序列拼接及PCR验证得到了SgHMGR-ORF。生物信息学软件预测该蛋白不含信号肽序列，但是在N端有2段跨膜区，因此在构建原核表达载体时避开了跨膜区，IPTG诱导16小时后的菌液上清中得到了融合蛋白的表达，经Western blot进一步检测确定SgHMGR的表达。SgHMGR基因在组培苗根茎叶中的表达情况发现在最高最低，构建亚细胞定位载体SgHMGR-pN-YFP转化烟草，结果显示定位于细胞质膜上与预测结果基本一致。另外还成功构建了1个植物过表达载体和2个干扰载体。

目录

综述

综述一 皂苷的研究进展

综述二 植物中角鲨烯环化酶研究进展

综述三 RNA干扰技术的研究与应用

第一部分 三倍体无籽罗汉果与二倍体罗汉果的转录组及表达谱差异分析

摘要

缩略词

引言

一、材料

二、方法

三、结果与讨论

3．1 两种倍性的罗汉果果实与种子表型

3．2 种子发育的光镜检测

3．3 转录组测序、组装与注释

3．4 表达谱测序

3．5 激素含量测定及相关基因的研究

3．6 三萜合成途径相关基因的分析

3．7 转录因子

本章小结

参考文献

第二部分罗汉果甜苷V生物合成中的4个关键酶基因的功能研究

摘要

缩略词表

引言

第一章 SgCS基因的克隆及功能研究

第一节 SgCS基因的全长克隆

第二节 SgCS基因的生物信息学分析

第三节 SgCS基因的时空表达分析

第四节 SgCS基因的原核表达研究

第五节 利用酵母表达研究融Cs基因的功能

第六节 SgCS基因的亚细胞定位研究

第七节 SgCS基因植物过表达载体的构建及根癌农杆菌介导转化拟南芥的研究

讨论

第二章 SgCAS基因的克隆及功能研究

第一节 SgCAS基因的全长克隆

第二节 SgCAS基因的生物信息学分析

第三节 SgCAS基因的时空表达模式研究

第四节 sgcAs基因的原核表达研究

第五节 SgCAS基因在酵母中表达研究

第六节 SgCAS基因的亚细胞定位研究

第七节 SgCAS植物RNA干扰载体的构建及转化烟草的研究

讨论

第三章 SgSQS基因的克隆及功能初步研究

第一节 SgSQS基因的RACE全长克隆

第二节 SgSQS全长基因的生物信息学分析

第三节 SgSQS基因在罗汉果中时空表达模式

第四节 SgSQS基因的原核表达研究

第五节 SgSQS基因的亚细胞定位研究

第六节 SgSQS基因的植物过表达载体及植物RNA干扰载体的构建

讨论

第四章 SgHMGR基因的全长克隆及功能初步研究

第一节 SgHMGR基因的RACE克隆

第二节 SgHMGR全长基因的生物信息学分析

第三节 SgHMGR基因在罗汉果不同组织中的表达模式

第四节 SgHMGR的原核表达研究

第五节 SgHMGR基因的亚细胞定位研究

第六节 SgHMGR基因植物过表达载体和干扰载体的构建

讨论

参考文献

个人简历

致谢

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