Treacher collins综合征致病基因筛查及BOR与eya4基因在内耳发育中的功能研究

摘要

第一部分Treacher Collins综合征致病基因筛查
　　 目的:分析已收集的两个Treacher Collins综合征(TCS)家系的临床表型特征，选取TCOF1基因进行突变检测分析。
　　 方法:收集患者及其家属病史，进行全身和专科检查。签署知情同意书后，抽取外周静脉血，提取DNA,通过聚合酶链反应(PCR)对TCOF1基因编码区的全部外显子进行扩增，纯化产物并在ABI测序仪上进行正反双向测序，利用GeneTool软件和分子生物学网站信息数据，分析耳聋患者的TCOF1基因突变。
　　 结果:TCS家系1可检测到TCOF1基因第25外显子c.4466_4370del GAAAA杂合突变，该突变使TCOF1基因发生移码突变。家系2先证者出现第25外显子c.4420T＞C杂合突变，该突变导致在1473位氨基酸提前产生了终止密码子(p.Q1473X)。位于TCOF1第25外显子的c.4420C＞T突变，国内外尚未见报道。
　　 结论:TCS患者临床表型特征有独特性，已明确其主要致病因素是TCOF1基因突变，为该家系有关遗传咨询和产前诊断提供了资料和依据。
　　 第二部分腮-耳-肾综合征(BOR)与eya4基因在内耳发育中的功能研究
　　 目的:据统计，全球中度以上的听力损失者约有2.78亿人。在我国听力语言残疾患者约有2780万人。聋病防治主要针对传导性耳聋和感音神经性耳聋。目前，传导性耳聋已有成熟的防治手段，而感音神经性耳聋的预防和治疗则是聋病基础研究的热点与难点。临床上，很多感音神经性耳聋是由内耳发育异常所引起。内耳发育畸形、毛细胞不可再生，听神经损伤难以修复，是目前需要攻克的难题。寻找更多的内耳畸形、耳聋致病基因，探索致畸致聋机制，并针对发病机制筛选特异性的治疗途径，已成为耳科学基础与临床研究者的共同目标。eya4基因编码一种转录因子，低表达斑马鱼eya4基因，可见毛细胞数目减少、半规管嵴发育不良，因此eya4得到更多学者的关注。斑马鱼胚胎透明、易于操作内耳发育机制与人类相似，可作为研究内耳发育畸形和耳聋的优势模型。本实验主要研究eya4基因对斑马鱼内耳发育的影响，为内耳畸形、感应神经性耳聋的防治奠定理论基础。
　　 方法:主要采用斑马鱼胚胎内注射寡核苷酸Morpholino(MO)和mRNA的方法，构建eya4基因低表达和过表达模型;通过表型观察、原位杂交、抗体染色等方式，研究eya4基因对斑马鱼内耳发育的作用;通过筛选与内耳发育密切相关的基因表达变化，研究eya4基因影响内耳发育的机制。
　　 结果:斑马鱼eya4基因，在14hpf开始表达于耳泡;随着胚胎发育，eya4在耳泡及侧线中持续表达，表达范围主要分布于有毛细胞生长的区域，如眼周围、内耳、及后侧线的神经丘内。通过Morpholino低表达eya4后，75％的胚胎未观察到内耳明显畸形，后期研究主要集中于内耳的功能。通过Morpholino低表达eya4后，发现毛细胞排列异常、听神经细胞减少;同时，同家族的eyal基因共同低表达后，毛细胞的数目大幅度减少，由此推测二者具有协同作用。
　　 结论:本实验探讨了eya4基因在斑马鱼内耳发育的作用。低表达eya4基因可导致耳泡内毛细胞排列异常，进而影响纤毛基部神经突触的传输信号，这很可能归因于pax-eya-six-dauch通路中，早期eya4基因与six4.1基因相互作用所引起。

目录

论文说明

摘要

英文缩略词表

前言

参考文献

第一部分 Treacher Collins综合征致病基因筛查

一、前言

二、材料与方法

(一)研究对象

(二)Treacher collins综合征表型分析

(三)遗传方式分析

(四)实验仪器及试剂

(五)实验方法

三、结果

(一)家系分析

(二)候选基因突变位点筛选

(三)突变位点蛋白预测

四、讨论

(一)TCS临床特征与突变位点

(二)TCOF1／Treacle的结构及作用

(三)TCOF1／Treacle颅面骨发育中的意义

(四)TCS的治疗

五、小结

参考文献

第二部分 腮-耳-肾综合征(BOR)与eya4基在内耳发育中的功能研究

一、前言

二、材料与方法

(一)胚胎总RNA的提取

(二)RT-PCR

(三)质粒构建

(四)斑马鱼胚胎的显微注射

(五)斑马鱼整体胚胎原位杂交技术

(六)斑马鱼胚胎的免疫荧光实验

(七)突变体构建

三、结果

(一)eya4基因在斑马鱼内耳的时间和空间表达谱

(二)反义吗啉寡核苷酸(Morpholino MO)有效性验证

(三)反义吗啉寡核苷酸(Morpholino Mo)阻滞eya4基因表达斑马鱼表型变化

(四)eya4基因下调与内耳细胞发育

(五)下调eya4基因对pax-six-dauch通路的影响

(六)cas9-eya4突变体鉴定

四、讨论

(一)模式动物斑马鱼的优点

(二)下调eya4基因可能影响内耳相关细胞的分化和凋亡

(三)低表达eya4的表达调控

(四)构建eya4突变体意义

五、小结

参考文献

综述

个人简历

致谢

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