生殖道支原体流行病学研究及BALB/c小鼠下生殖道感染模型建立

摘要

支原体是一类缺乏细胞壁、基因组较小的原核微生物。目前已被证实对人类有致病性的6种支原体中，3种为生殖道支原体:分别为生殖支原体（Mycoplasmagenitalium，Mg）、解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum, Uu）和人型支原体（Mycoplasma hominis, Mh）。生殖道支原体主要吸附于泌尿生殖道上皮及精子等细胞表面，可导致非淋菌性尿道炎(Non-gonococcal urethritis，NGU)、持续性或复发性尿道炎、附睾炎、子宫内膜炎、盆腔炎（Pelvic inflammatory disease，PID）、及早产、胎膜早破等不良妊娠结局等。 Mg近年来被证实为一种性传播疾病(Sexual transmitted diseases，STD)病原体。流行病学研究表明，患有急性NGU的男性患者中Mg感染率为5％-42％，而在非淋菌性非沙眼衣原体性尿道炎(Non-chlamydial non-gonococcal urethritis，NCNGU)患者中，感染率为18％-46％。此外，越来越多的研究发现Mg感染后可促进HIV的感染和传播。然而不同于其他支原体或STD病原体，国内外在Mg感染现状的流行病学报道较少。仅有的一些流行病学研究也集中于女性性工作者(Female sex workers，FSWs)及STD门诊患者等群体，不能反映其他人群中的Mg感染情况。男男性行为者(Men who have sex with men，MSM)作为HIV感染及传播的高危人群，因其HIV感染率逐年增加而受到了性病预防控制中心的高度重视，但目前仅有数篇文献报道了该人群中Mg的感染情况。因此，了解该人群中Mg的流行情况并分析Mg与HIV之间的关系，对HIV的控制和预防有着重要意义。 流行病学研究是基于临床或人群的研究，可提供横断面数据。考虑到人体生殖道局部环境较为复杂，可并存其他多种微生物，在临床症状方面也有一定的协同作用。动物模型则是一种比较直观的研究方法，可尽最大可能统一宿主条件，避免众多临床因素引起干扰，可进一步探讨致病机制及致病因素。Mg生长缓慢、对培养要求条件苛刻、培养极其困难，自1981年首次被报道以来，仅1例成功建立动物模型的研究。而Uu的体外培养较为容易，较多研究使用Uu建立动物模型。Uu被分为生物群1(Parvo)及生物群2(T960)两个亚群:生物群1包括血清型1、3、6、14型，生物群2包括2、4、5、7-13型等10个血清型。Uu感染后可导致多种泌尿生殖道疾病甚至垂直传播导致新生儿支原体感染等，但目前关于Uu的致病性是否和特定血清型相关、Uu致病性与宿主之间的关系等仍不清楚。多数流行病学研究仅从生物群水平探讨两个生物群间感染率的差异，而不足以解释Uu各血清型之间的致病性差异。相关的动物研究也多关注于单个型别或一些常见型别，而对少见型别如血清型2、9、5、7等的致病性情况并无较多了解。此外，目前多使用Uu常见型别建立药效评价模型，而忽视了其致病特征与特定血清型之间的关系。因此，建立Uu的14个型别的动物模型可深入了解Uu各型别间致病性差异，并为筛选最适血清型建立药效评价模型提供基础。全文分为两部分，各部分主要内容分述如下: 第一部分:深圳男男性行为者生殖支原体流行病学调查及危险因素分析 于2010年1月至5月，对深圳的MSM人群进行抽样调查。在深圳MSM人群聚集的娱乐场所或公共场所纳入合适的研究对象并采集人口社会学资料、收集受试者首段尿(First void urine，FVU)及直肠拭子标本，采用Taqman MGB荧光定量PCR法检测Mg DNA，并分析Mg感染的危险因素。研究期间共有409名MSM被纳入，以汉族、外来人口为主。其中95.5％(374/390)自我认同为同性恋，89.4％(349/390)仅与男性或较少女性发生性行为，22.9％（93/406）曾参加过性交易活动。95.1％(386/406)最近半年内曾与男性发生过肛交性行为，其中71.4％(275/385)使用了安全套。26.1％(106/405)最近半年内曾与女性发生性关系。55.7％(228/405)借助互联网寻找性伴。共收集811份直肠拭子和尿液标本，Mg总阳性率为8.1％(33/406，95％CI5.7％-10.6％)。406份FVU中Mg阳性率为3.4％(14/406，95％CI1.7％-5.4％)，405份直肠拭子标本中阳性率为5.4％(22/405，95％CI3.5％-7.7％)。单因素分析及多因素分析均显示:较多与女性发生性关系者、在过去6个月内发生过无保护肛交者较仅与男性发生性关系者及未发生无保护肛交者Mg感染风险升高。提示MSM人群中Mg感染的主要部位可能是直肠，且双性恋人群是Mg感染及传播的高危人群，应引起进一步的重视。 第二部分:解脲脲原体14血清型BALB/c小鼠感染模型中致病性初探 采用雌性7周龄BALB/c小鼠及ATCC保藏的Uu14个血清型标准菌株建立动物模型。设立空白对照组、雌激素对照组及14个血清型感染组，每组随机分配15只小鼠。除空白组外，雌激素对照组与各型别感染组小鼠分别经阴道接种无菌Uu液体培养基及颜色改变单位（Color change unit, CCU）浓度为1×107CCU/mL的各型别标准菌液，接种后定期观察小鼠外阴形态变化。接种后第3、7、14、21天，对各组小鼠采集阴道冲洗液并进行培养、CCU法定量并检测肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosis factor，TNF)-α、白介素(Interleukin，IL)-1β水平。接种后第3、21天，每组随机处死5只小鼠，取阴道、子宫标本，甲醛溶液固定后进行组织病理检查。研究发现接种后空白对照组和雌激素对照组两组小鼠阴道冲洗液中均无Uu生长、各时间点阴道冲洗液中TNF-α及IL-1β均维持在较低水平。UUR各感染组各时间点小鼠阴道冲洗液培养阳性率较UPA高，且随着时间延长CCU逐渐下降。各感染组TNF-α及IL-1β水平变化呈现不同趋势:血清型1/4型接种后第3天炎性因子水平达到峰值，而至接种后21天则下降至对照组水平;血清型8/13组小鼠阴道冲洗液中两炎性因子水平至感染后第14天达到最高值，此后逐渐降低至对照组水平;血清型2/7/9/11/12/14型接种后两炎性因子水平逐渐升高，至接种后第21天炎性因子达到峰值。组织病理结果显示，各型别接种后小鼠阴道组织几乎不被累及，子宫则出现不同程度的急慢性炎症反应，其中4型主要导致急性炎症反应，1/3/11/8型主要导致慢性炎症反应。提示BALB/c小鼠下生殖道感染Uu后，主要导致宫颈炎、子宫内膜炎。血清型1、3、14、4、8、11型可能是14个型别中的主要致病型别，而其他型别可能是条件致病菌或非下生殖道常驻菌群。血清型13型可能导致隐性感染。血清型3、14、8、11型感染后在BALB/c小鼠下生殖道中定植时间较长，可导致子宫持慢性炎症反应，可能更适合作为药效评价模型的感染型别。

目录

英文缩略词

摘要

前言

第一部分 深圳男男性行为者生殖支原体流行病学调查及危险因素分析

摘要

第一章 研究背景

第二章 研究对象和方法

1．研究对象

2．调查流程

3．调查问卷及知情同意书

4．试剂、仪器耗材及引物

5．标本DNA提取步骤

6．制备阳性阴性对照

7．Mg DNA检测

8．统计分析

第三章 结果

1．人口社会学特征

2．Mg感染情况

3．危险因素分析结果

第四章 讨论

第二部分 解脲脲原体14血清型BALB／c小鼠感染模型中致病性初探

摘要

第一章 研究背景

第二章 UPA在BALB／c小鼠生殖道感染模型的建立

1．研究目标

2．材料与方法

3．结果

4．总结

第三章 UUR在BALB／c小鼠生殖道感染模型的建立

1．研究目标

2．材料与方法

3．结果

4．总结

第四章 讨论

1．动物模型建立

2．Uu各血清型致病性情况

3．与病理的联系

4．对流行病学及药效学模型的启示

5．本研究的不足之处

全文小结

参考文献

论文相关综述 解脲脲原体泌尿生殖道感染动物模型研究进展

论文相关论著

在读期间文章发表及会议投稿情况

在读期间参加学术活动及社会实践情况

致谢

声明